瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作為介質(zhì)的一種電泳方法，其兼具“分子篩”和“電泳的雙重作用。

瓊脂糖(Agarose)是一種線性多糖聚合物，是從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)的，當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。

經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的低熔點(diǎn)的瓊脂糖，在結(jié)構(gòu)上比較脆弱，因此在較低的溫度下便會(huì)熔化，可用于核酸片段的電泳檢測(cè)。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法的可信度非常高。

瓊脂糖凝膠電泳的原理

熒光染料檢測(cè)核酸的存在

觀察瓊脂凝膠中核酸的最簡(jiǎn)單方法是利用熒光染料溴化乙錠 (EB) 進(jìn)行染色，所用的熒光染料含有一個(gè)可以嵌入核酸的堆積堿基之間的熒光基團(tuán)，當(dāng)染料與核酸結(jié)合后呈現(xiàn)熒光。

核酸吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，被結(jié)合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，這兩種情況下，被吸收的能量可在可見(jiàn)光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來(lái)，因此，當(dāng)凝膠中含有游離的EB時(shí)即可以檢測(cè)到DNA和RNA的存在。

注1：由于EB具有很強(qiáng)的毒性，因此在操作時(shí)一定要戴手套，并且最好有專門(mén)的區(qū)域進(jìn)行電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的檢測(cè)效果，同時(shí)毒性要低很多。

電泳區(qū)分核酸大小

核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，瓊脂糖凝膠電泳即根據(jù)這個(gè)原理對(duì)核酸進(jìn)行區(qū)分。

核酸分子在pH高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于核酸的戊糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上具有重復(fù)性，長(zhǎng)度相同的核酸鏈幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。

此外，含有瓊脂糖的凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在瓊脂糖凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

在同樣電場(chǎng)的強(qiáng)度下，核酸分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型以及瓊脂糖凝膠的濃度，簡(jiǎn)而言之，分子量較大的核酸遷移速度較慢，分子量較小的核酸遷移速度較快，這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離核酸片段的基本原理。

瓊脂糖凝膠電泳的操作

試劑配置

5×TBE儲(chǔ)備液：

Tris，54g；

硼酸，27.5g；

0.5M EDTA，20mL，pH為8.0；

蒸餾水1000mL；

4攝氏度保存。

注1：0.5M EDTA配置：向18.61g EDTA中加入一定量的雙蒸水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，之后在用100mL容量瓶定量。

注2：使用時(shí)將儲(chǔ)存液稀釋10倍至0.5×，作為電泳及制膠的緩沖液。

注3：5×TBE緩沖液放置時(shí)間過(guò)久會(huì)沉淀，因此一次性不要配太多。

注4：工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

制膠

根椐制膠量及凝膠濃度，向三角錐形瓶中加入指定體積的0.5×TBE緩沖液和準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉；

將錐形瓶放入微波爐中加熱溶解瓊脂糖；

使溶液冷卻至50℃～60℃左右，加入EB染料，并充分混勻；

將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子；

在室溫下使膠凝固，大約30分鐘~1小時(shí)。

其它注意事項(xiàng)：

一般小膠需要緩沖液30～40mL，大膠70～80mL；

加熱火力不要太大，以防緩沖液沸騰后溢出錐形瓶；

可以反復(fù)多次加熱，以保證瓊脂糖完全溶解；

如使用GoldView染料，加熱后無(wú)需冷卻即可直接添加染料；

染料添加量為小膠2μL，大膠4μL。

上樣

取適量樣品與6×loading buffer混勻 (一般為5μl樣品加1μl 6×loading buffer)，用微量移液槍小心加入樣品孔中；

將5μl marker用微量移液槍小心加入到樣品孔中；

每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止互相污染；

注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

電泳

加完樣后，合上電泳槽蓋，接通電源；

設(shè)置合適的電壓和電流，開(kāi)始電泳；

當(dāng)條帶移動(dòng)到膠塊2/3以上時(shí)，停止電泳；

在凝膠成像系統(tǒng)中拍照并觀察。

檢測(cè)DNA一般采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，低電壓長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行，至少要用lambda DNA或Hind III DNA marker。

檢測(cè)RNA一般采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V～180V，電泳30min左右。

瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果

理想的電泳結(jié)果

DNA的電泳：如果在23kb處有一條完整或略脫尾的條帶，則證明DNA完整性很好。

RNA電泳中一般會(huì)出現(xiàn)3個(gè)條帶，分別為28S、18S和5S rRNA，有時(shí)5S rRNA檢測(cè)不到。

電泳結(jié)果異常及可能原因分析

加樣孔有熒光

出現(xiàn)這種情況通常為蛋白質(zhì)殘留，雖然蛋白質(zhì)不會(huì)被熒光染料染色，但蛋白質(zhì)會(huì)與比較大的核酸結(jié)合，使得核酸不能跑出上樣孔，因而在孔中產(chǎn)生熒光。

核酸降解

核酸降解的現(xiàn)象主要表現(xiàn)為，主帶并不突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。

以目前核酸提取方法的能力，在裂解和提取過(guò)程中除了操作失誤幾乎并不會(huì)導(dǎo)致核酸的降解，所以出現(xiàn)提取核酸降解的情況，一般為樣品本身在提取前就有一定程度的核酸降解。

樣品本身出現(xiàn)核酸降解一般分為兩種，一種是樣品采集和保存出現(xiàn)問(wèn)題，比如以RNA提取為目的的樣品在采集后在常溫下存放了很長(zhǎng)時(shí)間；另一種是樣品本身就存在一定的核酸降解，比如土壤或沉積物樣品中本身就存在很多長(zhǎng)短不一的胞外DNA。

核酸提取失敗

一般核酸提取失敗的結(jié)果顯示為沒(méi)有明顯的主帶，而是在一個(gè)較大的范圍內(nèi)呈現(xiàn)彌散狀態(tài)。

不同類型核酸殘留

在DNA或RNA提取過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)其它類型核酸殘留的現(xiàn)象，比如在提取的DNA中存在RNA殘留，或者在提取的RNA中存在DNA殘留，此時(shí)的電泳結(jié)果會(huì)同時(shí)觀察到DNA和RNA。

針對(duì)這種情況的處理辦法是在提取過(guò)程中添加一步DNase或RNase的處理，以去除不是提取目標(biāo)的核酸。

制膠不合格

如果電泳的結(jié)果顯示marker跑的都有問(wèn)題，那一般就是制膠的過(guò)程出現(xiàn)了問(wèn)題，建議首先重新配置TBE緩沖液，并重新制膠，確保在制膠過(guò)程中瓊脂糖混合均勻。

其次是要更換電泳槽中的緩沖液，電泳槽中緩沖液使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響其導(dǎo)電能力。

如果問(wèn)題依然出現(xiàn)，就要考慮是不是瓊脂糖的問(wèn)題，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上假的瓊脂糖非常多，本人就遇到過(guò)因?yàn)榄傊鞘巧秸浂鴮?dǎo)致電泳一直出現(xiàn)問(wèn)題的情況。