核酸質(zhì)控是NGS（Next Generation Sequencing）實(shí)驗(yàn)中必不可少的環(huán)節(jié)，精確的NGS實(shí)驗(yàn)結(jié)果也離不開合格的核酸質(zhì)控。核酸質(zhì)控主要是評估核酸的濃度，完整性、純度及片段大小。

核酸樣本涉及的下游實(shí)驗(yàn)很多，質(zhì)控不合格會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至得到錯(cuò)誤的結(jié)論。NGS實(shí)驗(yàn)中使用質(zhì)量差，如降解程度高的核酸樣本建庫可能導(dǎo)致文庫濃度低，文庫復(fù)雜度低，甚至文庫構(gòu)建失敗等；文庫濃度定量不準(zhǔn)確可能導(dǎo)致測序?qū)嶋H分配數(shù)據(jù)量不均，或簇密度波動(dòng)甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。詳情可參考往期內(nèi)容【新知解讀】測序失敗風(fēng)險(xiǎn)排查——多的是你不知道的事

現(xiàn)在市面上主流的核酸質(zhì)控方法有紫外可見吸收光度法（UV-Vis）（如Nanodrop）、熒光染料法（如Qubit）、瓊脂糖凝膠電泳法（如Gel-electrophoresis）、自動(dòng)化電泳法（如2100 Bioanalyzer）、熒光定量PCR法（如qPCR）等。

如何挑選合適的核酸質(zhì)控方法來保證NGS實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)展？相信是小伙伴們十分關(guān)注的問題。不要擔(dān)心！今天小石頭帶大家來回顧各種核酸質(zhì)控方法的原理及應(yīng)用。

生物有機(jī)分子中的芳香環(huán)，具有紫外吸收的特性。核酸，蛋白質(zhì)、多肽、芳香基團(tuán)、苯酚以及碳?xì)浠衔锞晌兆贤夤?。核酸?60 nm波長處具有最高吸收峰，蛋白質(zhì)在280 nm波長處具有最高吸收峰，碳水化合物在230 nm波長處具有最高吸收峰 。

根據(jù)朗伯-比爾（Beer-Lambert）光吸收定律：當(dāng)一束平行單色光垂直入射通過均勻、透明的吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液對光的吸收程度（K）與溶液的濃度（c）及液層厚度（b）的乘積成正比。即：A=Kbc，式中K為吸光系數(shù)；A為吸光度；b為溶液液層厚度（或稱光程長度）；c為溶液濃度。

一般在260 nm下，1 μg/ml DNA溶液在1 cm光徑比色皿中的吸光系數(shù)為0.020，1 μg/ml?RNA溶液在1 cm光徑比色皿中的吸光系數(shù)為0.022。

紫外分光光度計(jì)能通過測量入射光穿過樣品后到達(dá)檢測器的衰減程度，來表示為溶液中樣品的吸光度值，通過測定吸光度值即可得出待測樣本的濃度。與此同時(shí)，還能通過計(jì)算A260/A280 和A260/A230的數(shù)值，評估核酸的純度。較純凈的核酸A260/A230應(yīng)大于2.0；較純凈的DNA A260/A280在1.8-1.9，較純凈的RNA A260/A280在1.9-2.0，樣品中如果含有蛋白質(zhì)及苯酚，A260/A280比值會明顯下降。

圖1. 紫外可見吸收光度法原理示意圖

實(shí)驗(yàn)室中紫外可見光度法定量RNA/DNA廣泛使用的是 Nanodrop系列分光光度計(jì)。

其優(yōu)勢是：操作簡單，無需樣本制備、染料或標(biāo)準(zhǔn)品；可以直接測量純度比—A260/280 和 A260/230；部分儀器還可識別樣品中的非核酸污染物。其缺點(diǎn)是：不具有選擇性（無法區(qū)分 DNA 或 RNA）；靈敏度有限，無法完成低濃度樣本的精確定量。

圖2.  Nanodrop儀器

基于所使用的是能與特異的靶分子結(jié)合的熒光染料，可選擇性結(jié)合 DNA、RNA 或蛋白，這些熒光染料僅在與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)才發(fā)出信號。

樣品被過濾光激發(fā)（在激發(fā)波長處）并由檢測器記錄發(fā)射光（在發(fā)射波長處）。熒光計(jì)可根據(jù)激發(fā)波長和發(fā)射波長測量特異性結(jié)合在生物分子和天然熒光分子上染料的熒光信號強(qiáng)度。

通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制校正曲線，并將樣品的熒光信號擬合到適當(dāng)?shù)幕貧w模型中，即可測量核酸濃度。

實(shí)驗(yàn)室中用熒光染料法測定核酸濃度常用Qubit熒光計(jì)。其特異性和敏感性比紫外分光光度計(jì)更高，但無法提供核酸純度信息，也無法檢測文庫中的非特異性片段，如引物二聚體，接頭序列等。

根據(jù)靶向分子的不同，Qubit包含dsDNA/總RNA/microRNA/ssDNA/蛋白質(zhì)檢測試劑盒，NGS實(shí)驗(yàn)中樣品定量常用Qubit? 1X dsDNA HS檢測試劑盒。

圖4 Qubit熒光計(jì)及其檢測試劑盒

瓊脂糖凝膠電泳可定性分析樣本濃度，片段大小、完整性及純度，但不能準(zhǔn)確定量。福爾馬林固定石蠟包埋樣本（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）是NGS腫瘤基因檢測最常用的樣本之一。在文庫構(gòu)建之前，常用瓊脂糖凝膠電泳評估FFPE樣本中制備的DNA的片段完整性。

常用2100 Bioanalyzer對樣品進(jìn)行分離。該方法采用微流控技術(shù)，在玻璃芯片上蝕刻若干微米級通道，構(gòu)建“微型實(shí)驗(yàn)室”，當(dāng)給芯片加入電壓時(shí)，樣品在芯片上的顯微蝕刻管道中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

主要原理為DNA雙鏈可嵌入凝膠-染料基質(zhì)中的熒光染料，利用激光誘導(dǎo)的熒光檢測（laser induced fluorescence，LIF）技術(shù)，儀器自動(dòng)檢測電泳過程中根據(jù)大小被分離的片段，并將其轉(zhuǎn)換成凝膠狀圖像（條帶）和電泳圖（峰）。

利用已知片段大小和濃度的Ladder和Marker，生成遷移時(shí)間與片段大小的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品峰面積對已知濃度的Marker或Ladder面積的比值來對樣品的大小和濃度進(jìn)行定量。

圖6. 微流控芯片的工作原理

實(shí)驗(yàn)中常用的2100生物分析儀現(xiàn)在已廣泛取代了繁瑣的凝膠電泳技術(shù)成為RNA樣品質(zhì)量控制（QC）的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)在DNA 片段分析和蛋白樣品SDS-PAGE分析方面也正在迅速取代凝膠電泳技術(shù)。目前安捷倫2100生物分析儀有DNA/RNA/蛋白質(zhì)/細(xì)胞分析試劑盒與試劑，NGS實(shí)驗(yàn)中如檢測DNA，常選擇DNA 1000 Kit 或 High Sensitivity DNA Kit 對文庫的片段大小進(jìn)行質(zhì)控。

圖7. 2100生物分析儀及其芯片類型

利用qPCR技術(shù)對產(chǎn)物定量，是在PCR體系中添加可與DNA結(jié)合的熒光染料。游離狀態(tài)的熒光染料幾乎沒有熒光信號，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。

隨PCR循環(huán)數(shù)增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量增加，熒光信號呈指數(shù)增長，而熒光信號強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。在PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物（熒光信號）達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)稱為Ct值，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系。

市面上常用羅氏的KAPA hgDNA Quantification and QC Kit 評估DNA質(zhì)量。通過在PCR體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)擴(kuò)增，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)對起始產(chǎn)物濃度進(jìn)行相對定量。主要針對于人類基因組單拷貝的高度保守區(qū)域的不同位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的引物預(yù)混液。最小片段所對應(yīng)的引物用于獲得絕對定量的結(jié)果，而額外的引物用于獲得在DNA樣本中可擴(kuò)增模板量(質(zhì)量高的DNA片段)的信息，原理如圖7。由此所產(chǎn)生的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(即Q-ratios)，可以用于樣本產(chǎn)量或?qū)τ谌鏔FPE DNA等質(zhì)量變化很大的樣本的工作流程進(jìn)行調(diào)整。除此之外還有應(yīng)用在各種測序平臺對NGS文庫進(jìn)行精確定量KAPA Library Quantification Kits等試劑盒。

圖8. hgDNA Quantification and QC assay 原理示意圖

目前在NGS實(shí)驗(yàn)中常用的質(zhì)控方法如上，不同的檢測方法各有其特點(diǎn)及應(yīng)用場景，選擇合適的質(zhì)控方法對于下游實(shí)驗(yàn)的順利運(yùn)行具有極其重要的作用。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，相信簡便的操作、較高的靈敏度、極高的準(zhǔn)確性將是核酸檢測技術(shù)的趨勢。

今天的分享就到這里啦，小石頭祝愿老師們都能獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果~

參考文獻(xiàn)：

[1]核酸定量支持 - 入門 | Thermo Fisher Scientific - CN

[2]RNA/DNA 核酸定量 | Thermo Fisher Scientific - CN

[3]Qubit? 1X dsDNA HS 檢測試劑盒 (thermofisher.cn)

[4]用于樣品質(zhì)量控制的生物分析儀自動(dòng)化電泳 | 安捷倫 (agilent.com.cn)

[5]KAPA_hgDNA_Quantification_and_QC_Kit_TDS.pdf (roche-diagnostics.cn)