泛癌免疫基因組分析揭示基因型與免疫表型的關(guān)系和檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子

Pan-cancer Immunogenomic Analyses Reveal Genotype-Immunophenotype Relationships and Predictors of Response to Checkpoint Blockade

研究背景

1、免疫治療正在改變的晚期腫瘤的治療情況，但仍有很多患者對(duì)免疫治療沒(méi)有好的反應(yīng)。
2、以前的研究使用TCGA的基因組數(shù)據(jù)來(lái)描述新抗原及其與生存的關(guān)系，或使用兩個(gè)基因的表達(dá)估計(jì)細(xì)胞溶解。 然而，這些研究并沒(méi)有描述腫瘤內(nèi)免疫浸潤(rùn)的細(xì)胞組成。

本文通過(guò)對(duì)基因組的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，描述腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其中基因與免疫表型的關(guān)系，并預(yù)測(cè)免疫治療的效果。

全文概要

上圖示本文基本框架，通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，提取腫瘤中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、新抗原和CGAs（腫瘤-種系抗原）的信息，并將結(jié)果存放在TCIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)其中的免疫表型信息進(jìn)行分類(lèi)，計(jì)算免疫表型評(píng)分。然后在腫瘤組織中進(jìn)行驗(yàn)證，先進(jìn)行RNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用前面的方法進(jìn)行免疫表型評(píng)分，根據(jù)免疫表型評(píng)分的情況作出相應(yīng)的免疫表型圖，并發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出左邊這種免疫表型的腫瘤免疫治療好，表現(xiàn)為右邊這種免疫表型圖的患者免疫治療的效果欠佳。

腫瘤免疫的高分辨率基因組分析

免疫基因組學(xué)分析和用于分析的數(shù)據(jù)類(lèi)型

泛癌免疫基因組學(xué)分析的流程圖：首先從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和抗CTLA4、PD-1單抗的臨床試驗(yàn)中提取生存信息、SNP array （單核苷酸多態(tài)性微陣列）、WES（全外顯子組測(cè)序）和RNA測(cè)序的數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，提取HLA allele（人類(lèi)白細(xì)胞抗原等位基因）、克隆或亞克隆的突變信息，由新抗原和腫瘤-種系抗原（ CGAs ）組成的腫瘤抗原基因組信息，還有TILs和免疫表型信息。TILs，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的信息是通過(guò)GSEA和反褶積兩種方法從基因表達(dá)數(shù)據(jù)中估計(jì)。免疫表型，使用TILs和預(yù)先確定的基因集(MHC分子、免疫刺激因子和免疫抑制劑)來(lái)定義。分析的結(jié)果放在可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)訪(fǎng)問(wèn)的數(shù)據(jù)庫(kù)The Cancer Immunome Atlas（TCIA）中。

免疫相關(guān)特征數(shù)據(jù)處理過(guò)程

免疫相關(guān)的特征數(shù)據(jù)來(lái)源于純化的免疫細(xì)胞，正常組織和腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)譜，并用TCGA RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）后得到，分析的結(jié)果放在TCIA數(shù)據(jù)庫(kù)中。

免疫浸潤(rùn)的細(xì)胞特征揭示了與不同腫瘤的預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型

腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞類(lèi)型與預(yù)后的關(guān)系。

如A圖示ssGSEA作的氣泡圖，圖中展示了19種實(shí)體瘤的免疫細(xì)胞亞群。最上面這排是19種實(shí)體瘤，左邊是縮寫(xiě)，右邊圖例顯示他們的全稱(chēng)，最左邊這列是免疫細(xì)胞亞群。其中圓圈的大小指其中富集的樣本量大小，藍(lán)色表示與生存期呈正相關(guān)，紅色表示與生存期呈負(fù)相關(guān)。不難發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤中，與生存相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是不同的。 一般而言，與適應(yīng)性免疫相關(guān)的許多TIL亞群的浸潤(rùn)與良好的預(yù)后相關(guān)，比如活化的CD8 + T細(xì)胞，Tcm （central memory）（中樞記憶）和Tem（effector memory）（效應(yīng)記憶） CD8 +細(xì)胞和Tem CD4 +細(xì)胞， 而MDSC（骨髓源性抑制細(xì)胞）和Tregs（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）與不良預(yù)后相關(guān)。

突變負(fù)荷和組織環(huán)境決定免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的組成

突變負(fù)荷對(duì)免疫浸潤(rùn)細(xì)胞組成的影響
如圖所示，從左到右將腫瘤分為高突變負(fù)荷、中突變負(fù)荷、低突變負(fù)荷三組，藍(lán)色是指免疫細(xì)胞富集，黃色指免疫細(xì)胞耗竭。具有高突變負(fù)荷的腫瘤富含活化的T細(xì)胞和Tem （效應(yīng)記憶）細(xì)胞，免疫抑制性Tregs （調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和MDSC （骨髓源性抑制細(xì)胞）呈衰竭狀態(tài)；而具有低突變負(fù)荷的腫瘤顯示相反趨勢(shì)，富集免疫抑制性Tregs （調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和MDSC （骨髓源性抑制細(xì)胞）細(xì)胞，活化的T細(xì)胞和Tem （效應(yīng)記憶）細(xì)胞呈衰竭狀態(tài)。

在特定腫瘤中，不同突變組的TIL組成不同。

這里最左邊的三個(gè)分組分別是高突變、中突變和低突變負(fù)荷組，最上面這行指的是19個(gè)腫瘤，可以發(fā)現(xiàn)，在同一個(gè)腫瘤中，在不同突變負(fù)荷組內(nèi)，TIL的組成是不同的。

和前面的圖類(lèi)似，這里分析的是在腫瘤中富集的免疫細(xì)胞亞群，在不同突變負(fù)荷組內(nèi)的TIL組成情況。在各個(gè)腫瘤中富集的免疫細(xì)胞亞群，在不同突變負(fù)荷組內(nèi)的TIL組成也是不同的。

使用降維技術(shù)分析肺腺癌中淋巴細(xì)胞亞群， （左圖）用平均歸一化富集評(píng)分[NES] 分析所有淋巴細(xì)胞類(lèi)型，（右圖）用t-SNE分析選定的幾個(gè)細(xì)胞亞群，與免疫抑制相關(guān)的亞群(MDSCs （骨髓源性抑制細(xì)胞）、Tregs)與效應(yīng)因子功能相關(guān)的亞群(活化的T細(xì)胞、Tcm細(xì)胞、Tem?CD4+和CD8+細(xì)胞)在空間上是分離的。

在腫瘤進(jìn)展的不同階段有不同的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式。

基于來(lái)自GSEA的NES評(píng)分計(jì)算的腫瘤I期至IV期腫瘤的免疫細(xì)胞類(lèi)型的富集（藍(lán)色）和耗竭（黃色）情況的火山圖。藍(lán)色代表細(xì)胞富集，黃色代表細(xì)胞耗竭。Tem?CD8+T細(xì)胞在I期和II期腫瘤中富集，在III期和IV期腫瘤中是耗竭的。相反，Tregs和MDSCs在早期腫瘤中減少，在晚期腫瘤中增加。相應(yīng)的，與適應(yīng)性免疫相關(guān)的TIL亞群的富集從I期降至IV期，而與固有免疫相關(guān)的TIL的富集從I期增加至IV期。這表明免疫細(xì)胞成分在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中向免疫抑制表型轉(zhuǎn)移。

這些分析表明，基因組譜和特定的組織背景都對(duì)免疫浸潤(rùn)的細(xì)胞組成有影響。同時(shí)，這個(gè)研究結(jié)果也支持了腫瘤進(jìn)展過(guò)程中免疫系統(tǒng)也在進(jìn)化這個(gè)觀點(diǎn)。

CGAs與CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)

腫瘤抗原有可能引發(fā)腫瘤特異性的免疫反應(yīng)，主要由CGAs和新抗原構(gòu)成。 CGAs是一種通常由生殖系細(xì)胞表達(dá)但在腫瘤細(xì)胞中有異常表達(dá)的蛋白，而新抗原則是由基因編碼序列的突變或重新排列引起的。上圖為從CT數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cta.lncc.br）獲得的腫瘤種系抗原（CGAs）列表。這些CGAs中很多抗原的腫瘤特異性比較低，所以作者選擇了60個(gè)根據(jù)以前的報(bào)道，可能被T細(xì)胞靶向攻擊的CGAs進(jìn)行分析。

CGAs與實(shí)體瘤中Tem和/或Tcm CD8+?/CD4+細(xì)胞的活化顯著相關(guān)。

據(jù)既往研究我們可以知道，細(xì)胞溶解活動(dòng)和細(xì)胞表面表達(dá)的CGAs數(shù)量之間沒(méi)有明確的正相關(guān)關(guān)系，即不是腫瘤細(xì)胞表面的CGAs（腫瘤-種系抗原）數(shù)量越多，腫瘤細(xì)胞越容易死亡。本文中，作者研究了CGA和T細(xì)胞活化之間的關(guān)系。
圖中右邊指與CD8 +和/或CD4 + T細(xì)胞相關(guān)的腫瘤 - 種系抗原（CGAs），最上面橫坐標(biāo)指各個(gè)腫瘤類(lèi)型。藍(lán)色方塊顯示CGAs與相應(yīng)的腫瘤類(lèi)型顯著相關(guān)，右邊CAG名稱(chēng)后面括號(hào)里的數(shù)值是指，與這個(gè)CAG有顯著相關(guān)性的腫瘤的數(shù)量，比如第1個(gè)CSAG2這個(gè)CAG，與他顯著相關(guān)的腫瘤數(shù)量最多，有11個(gè)。在這里，作者指出了很多個(gè)與每種實(shí)體瘤中活化的，Tem和/或Tcm CD8 + / CD4 +T細(xì)胞顯著相關(guān)的CGA。

CGA評(píng)分與腫瘤間的突變負(fù)荷呈正相關(guān)。

這些在腫瘤中高表達(dá)的CGAs其實(shí)就是潛在的免疫治療靶點(diǎn)。作者預(yù)測(cè)了這些CGAs中與HLA分子結(jié)合的肽段，從而產(chǎn)生5775個(gè)獨(dú)特的肽段。 然后，通過(guò)計(jì)算CGA表達(dá)評(píng)分(實(shí)驗(yàn)程序)來(lái)估計(jì)抗原載量。上圖對(duì)CGA表達(dá)評(píng)分和腫瘤突變的關(guān)系進(jìn)行了分析，橫坐標(biāo)是各個(gè)腫瘤，按腫瘤突變負(fù)荷從低到高排列；縱坐標(biāo)是CGA表達(dá)評(píng)分。

新抗原景觀多樣而稀疏

新抗原的數(shù)量與突變負(fù)荷相關(guān)。

橫坐標(biāo)指各個(gè)腫瘤，從左到右腫瘤突變負(fù)荷越來(lái)越高，縱坐標(biāo)指新抗原的數(shù)量，很明顯，新抗原的數(shù)量和腫瘤突變負(fù)荷呈正相關(guān)。

每個(gè)突變產(chǎn)生的新抗原數(shù)量因腫瘤而異。

橫坐標(biāo)也是指各個(gè)腫瘤，縱坐標(biāo)是新抗原和突變數(shù)的比值，即每個(gè)突變產(chǎn)生的新抗原數(shù)量；圖中可見(jiàn)各個(gè)腫瘤中，每個(gè)突變產(chǎn)生的新抗原數(shù)量是不一樣的，范圍從黑色素瘤[SKCM]的0.93到腎細(xì)胞癌[KIRC]1.43不等。腫瘤之間的這些差異可能是由突變過(guò)程的差異導(dǎo)致。

前面這一系列的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，新抗原負(fù)荷以及CGA負(fù)荷和選定基因和免疫細(xì)胞亞群之間的關(guān)系在不同腫瘤中不是固定不變，而是高度可變的，這說(shuō)明免疫應(yīng)答可能受這兩種抗原的聯(lián)合作用控制。

不同腫瘤階段的新抗原負(fù)荷。

這里展示的是不同腫瘤階段的新抗原負(fù)荷，出乎意料的是，所有腫瘤從I期到IV期的新抗原載量?jī)H僅是略有增加。

實(shí)體腫瘤中共有的新抗原。

此圖展示的是實(shí)體瘤中各個(gè)患者共有的新抗原情況，方塊僅顯示在至少5％的腫瘤患者中共有的新抗原。THCA、PAAD、SKCM腫瘤患者中新抗原共享稍多，其他腫瘤中共享的抗原較少。所以，總體而言，新抗原很少在患者之間共享。

HLA（人類(lèi)白細(xì)胞抗原）分層的共享新抗原。

最上面是各個(gè)類(lèi)別的HLA，最右邊是各種新抗原。作者分析了911,548種獨(dú)特的新抗原中的共享新抗原，只有圖中展示的24種新抗原在至少5%的一種或多種腫瘤患者中共享。 我們可以發(fā)現(xiàn)，最常見(jiàn)的新抗原是由PIK3CA 、 RAS和BRAF等驅(qū)動(dòng)基因突變引起的。其中，只有兩種新抗原在一種腫瘤類(lèi)型中超過(guò)15%的患者中共享：KIGDFGLATEK在甲狀腺癌(THCA)和SKCM中的共享，KLVVVGADGV在PAAD中的共享。因此，新抗原是高度稀疏的，很少在腫瘤患者中共享。

腫瘤的基因型決定免疫表型和腫瘤逃逸機(jī)制

從前面的研究可以知道，高突變負(fù)荷的腫瘤中，效應(yīng)T細(xì)胞富集可能是抗原負(fù)荷較高導(dǎo)致的。作者進(jìn)一步提出，免疫表型與描述腫瘤基因組復(fù)雜性的其他基因組特征，比如腫瘤異質(zhì)性（高與低）和抗原性（高與低）之間有沒(méi)有關(guān)系，如果有，其中有著什么樣的關(guān)聯(lián)。

異質(zhì)性強(qiáng)的腫瘤突變負(fù)荷略低，但富含活化的T細(xì)胞和Tem細(xì)胞，并且免疫抑制細(xì)胞耗竭。

類(lèi)似的，新抗原頻率較高的腫瘤突變負(fù)荷略低，富含活化的T細(xì)胞和Tem細(xì)胞，并且免疫抑制細(xì)胞呈耗竭狀態(tài)。

THCA的基因型與特異性免疫表型相關(guān)。

作者選擇了具有最低和最高突變負(fù)荷的兩種腫瘤，即THCA和SKCM兩種腫瘤，并分析了它們?cè)诓煌蛐椭械拿庖弑硇?。上圖示THCA腫瘤中，BRAF-和RAS-突變的免疫細(xì)胞組成的情況。最上面的圖例指BRAF-和RAS-突變兩種基因型分類(lèi)，右邊是免疫細(xì)胞。從圖中可見(jiàn)，在THCA腫瘤中，不同的基因型中免疫的細(xì)胞組成不同，即免疫表型不同。

不同的基因突變表現(xiàn)出明顯不同的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞模式。

基于來(lái)自GSEA的NES評(píng)分計(jì)算的火山圖，顯示TCHA腫瘤中，BRAF-與RAS-突變時(shí)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。以BRAF突變?yōu)橹鲿r(shí)，MDSC等與免疫抑制相關(guān)的細(xì)胞富集，Tem等等與免疫活化相關(guān)的細(xì)胞呈衰竭狀態(tài)。

在BRAF-和RAS-突變的TCHA腫瘤中MHC和免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)。

其中， BRAF突變的腫瘤主要浸潤(rùn)免疫抑制細(xì)胞，而RAS突變的腫瘤則下調(diào)MHC分子和免疫調(diào)節(jié)分子。這說(shuō)明MHC、免疫刺激分子和免疫抑制分子的表達(dá)水平也與基因型有關(guān)，提示BRAF突變和RAS突變的THCA腫瘤有不同的腫瘤逃逸機(jī)制。

SKCM腫瘤中，基因型與不同的免疫表型相關(guān)。

圖4（I）基于來(lái)自GSEA的NES得分計(jì)算的SKCM腫瘤中，各基因型細(xì)胞浸潤(rùn)情況的火山圖。同樣的，不同基因型中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況也是不一樣的，比如BRAF型的腫瘤富含效應(yīng)T細(xì)胞，而其他基因型富含Treg等免疫抑制細(xì)胞。

SKCM腫瘤不同基因型的新抗原負(fù)荷（突變負(fù)荷）。

在SKCM隊(duì)列中，不同基因型腫瘤的新抗原負(fù)荷不同，因此作者推測(cè)突變負(fù)荷可能也會(huì)對(duì)免疫浸潤(rùn)情況產(chǎn)生影響。

同樣的，SKCM腫瘤中，四種基因型與MHC和免疫調(diào)節(jié)分子表達(dá)情況也有明顯差異。

以上的這些研究結(jié)果提示腫瘤的基因型決定了免疫表型和腫瘤的逃逸機(jī)制。

機(jī)器學(xué)習(xí)確定了實(shí)體瘤中腫瘤免疫原性的主要決定因素

腫瘤與各類(lèi)免疫相關(guān)的因素的關(guān)系。

這里分析了各種免疫相關(guān)因素和腫瘤的關(guān)系，免疫相關(guān)因素指左邊這一列，作者將免疫相關(guān)因素分為四類(lèi)，包括:(1) ?MHC?I類(lèi)、II類(lèi)、非經(jīng)典分子的表達(dá); (2)某些共抑制和共刺激分子的表達(dá)；（3）活化的CD8?+/CD4+?T細(xì)胞和Tem?CD8+?/CD4+細(xì)胞浸潤(rùn); (4)免疫抑制細(xì)胞(Tregs和MDSCs)浸潤(rùn)。

免疫表型圖

免疫表型評(píng)分與12種實(shí)體瘤的生存相關(guān)

作者根據(jù)免疫表型圖中代表性基因或基因組的表達(dá)計(jì)算了一個(gè)綜合評(píng)分，即免疫表型評(píng)分。分析顯示，免疫表型評(píng)分與12種實(shí)體瘤的生存相關(guān)，其中4種腫瘤具有顯著相關(guān)性：KIRC、SKCM、乳腺癌(BRCA)、膀胱癌(BLCA)。

免疫表型評(píng)分預(yù)測(cè)CTLA-4和PD-1阻滯劑的治療效果

抗CTLA-4抗體治療個(gè)體患者的免疫表型圖

在此研究的患者中，與腫瘤內(nèi)的平均表達(dá)相比，MHC上調(diào)，顯示為紅色，CP部分下調(diào)，顯示為藍(lán)色。但是有效和無(wú)效的患者M(jìn)HC上調(diào)和CP下調(diào)的程度是不一樣的，顏色深淺不同。

抗CTLA-4抗體治療個(gè)體患者中，對(duì)免疫治療有反應(yīng)的患者細(xì)胞毒細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞、Tγδ細(xì)胞、NK細(xì)胞)富集，和免疫抑制相關(guān)的MDSCs和Tregs呈耗竭狀態(tài)。

應(yīng)答者和非應(yīng)答者的免疫表型評(píng)分明顯不同。

縱軸指免疫表型評(píng)分，橫軸根據(jù)對(duì)免疫治療的反應(yīng)情況分成3個(gè)色塊，從圖中可見(jiàn)，應(yīng)答者和非應(yīng)答者的免疫表型評(píng)分明顯不同，這使從免疫表型圖分析得出的免疫表型評(píng)分能夠區(qū)分對(duì)免疫治療有效和無(wú)效的患者。

IPS（免疫表型評(píng)分）對(duì)于治療有效率具有更好的預(yù)測(cè)能力

抗PD-1免疫治療的患者中，免疫原性的決定因素在反應(yīng)者和非反應(yīng)者兩組人群中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。

抗PD-1免疫治療的患者中，有效者的腫瘤富含細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD8 + T細(xì)胞，Tgd細(xì)胞，NK細(xì)胞）并耗盡MDSC和Tregs。

抗PD-1免疫治療的患者中，免疫表型評(píng)分可以將對(duì)免疫治療有無(wú)應(yīng)答的患者進(jìn)行分層。

IPS（免疫表型評(píng)分）對(duì)抗PD-1抗體治療的患者也有較好的預(yù)測(cè)能力。