目前高通量測(cè)序技術(shù)可檢測(cè)的DNA或RNA樣本主要來(lái)源于患者的組織、細(xì)胞或體液。雖然來(lái)源不同，但在進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)時(shí)步驟相同，需要經(jīng)過(guò)樣本獲取及處理—核酸提取—核酸質(zhì)控—文庫(kù)構(gòu)建—文庫(kù)測(cè)序—數(shù)據(jù)分析等步驟。其中針對(duì)不同樣本類(lèi)型、不同核酸類(lèi)型（DNA或RNA），在樣本獲取、處理、核酸提取環(huán)節(jié)有一定區(qū)別。本篇將重點(diǎn)針對(duì)樣本獲取及處理環(huán)節(jié)的詳細(xì)要求展開(kāi)介紹。

樣本的采集、處理及儲(chǔ)存方法對(duì)高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果至關(guān)重要。適合臨床NGS分析的樣本類(lèi)型優(yōu)選新鮮組織標(biāo)本，也可選用甲醛固定-石蠟包埋（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE）樣本、腫瘤細(xì)胞學(xué)樣本及血漿（游離DNA/RNA）等^[1]。對(duì)于腫瘤體細(xì)胞變異初次NGS檢測(cè)時(shí)應(yīng)首選經(jīng)病理評(píng)估過(guò)的組織樣本，在此基礎(chǔ)上的再次檢測(cè)可選取液體樣本動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)^[2]。接受過(guò)靶向/免疫藥物治療的患者，應(yīng)盡可能使用治療后的樣本，以尋找治療后新出現(xiàn)的耐藥突變^[1]。

圖1 非小細(xì)胞肺癌患者常見(jiàn)靶向治療相關(guān)基因檢測(cè)流程^[3]

采集要求：獲取的樣本應(yīng)含有豐富腫瘤細(xì)胞，手術(shù)取樣后用生理鹽水沖洗至組織表面沒(méi)有明顯血跡，避免血液中g(shù)DNA污染。周?chē)装Y嚴(yán)重的腫瘤、黏液產(chǎn)生過(guò)高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細(xì)胞不能采集，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果（手術(shù)采集的腫塊組織不低于50mg（豌豆粒大?。?。穿刺樣本應(yīng)≥2條，長(zhǎng)度≥0.5 cm。新鮮樣本中腫瘤細(xì)胞的比例不應(yīng)低于20%）^[1],[4]。

處理方法：迅速置于液氮或保存在樣本保護(hù)劑中，盡早轉(zhuǎn)移到液氮罐或-80℃冰箱（保存在樣本保護(hù)劑中的樣本，需按照保護(hù)劑要求的保存條件進(jìn)行保存）。該過(guò)程應(yīng)在手術(shù)離體后30min內(nèi)完成，以防止RNA等核酸降解^[5]。

評(píng)估方法：可采用冷凍切片染色評(píng)估樣本中的腫瘤細(xì)胞含量^[1]。

圖2 左：液氮罐   右：液氮罐內(nèi)提桶（用于液氮的取出及樣本的保存）

采集要求：按病理操作規(guī)范進(jìn)行取材。盡量避免腫瘤細(xì)胞過(guò)少或未檢測(cè)到的腫瘤組織、病變中心廣泛纖維化的腫瘤、黏液產(chǎn)生過(guò)高的腫瘤、周?chē)装Y嚴(yán)重的腫瘤、含壞死組織過(guò)多的腫瘤、含鈣化灶并脫鈣處理過(guò)的腫瘤（組織樣本中腫瘤含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上，最佳含量為30%以上。腫瘤細(xì)胞體積至少達(dá)到0.2mm³。為保證 FFPE標(biāo)本 DNA 提取的成功率，盡可能送檢1年以?xún)?nèi)的蠟塊或6周以?xún)?nèi)的石蠟切片，切片厚度 4～5 μm；手術(shù)樣本（大樣本）：≥5 張；穿刺樣本（小樣本）：≥10 張。若組織樣本中腫瘤細(xì)胞含量較低，仍需進(jìn)行NGS檢測(cè)的話(huà)，應(yīng)盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞，并在報(bào)告中提示樣本局限性）^[1],[6]。

處理方法：務(wù)必在組織離體后30min內(nèi)浸入適量組織固定液中進(jìn)行固定（液體與組織大小比例為10:1），避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標(biāo)本應(yīng)切開(kāi)后充分固定至6-48h，不超過(guò)72h。小活檢標(biāo)本可固定6-12h^[1],[3]。

評(píng)估方法：制作石蠟切片時(shí)，切取5片連續(xù)切片，其中1片進(jìn)行HE染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量^[1]。

圖3 FFPE樣本切片示意圖

采集要求：cfDNA是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來(lái)源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊。使用EDTA抗凝真空采血管，采集5-10ml外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測(cè)^[1],[6]。

處理方法：使用EDTA抗凝真空采血管，采集5-10ml全血，4h內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存于-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融^[1]_。如外周血需長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，建議用商品化游離DNA樣本專(zhuān)用保存管，如Sterck BCT管，在常溫條件下，可穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)14天。

① 脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本用于基因檢測(cè)時(shí)，必須進(jìn)行病理質(zhì)控，確定標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量及與正常細(xì)胞的比例。符合質(zhì)量要求或通過(guò)腫瘤細(xì)胞富集處理后符合要求的標(biāo)本可直接抽提核酸，也可以制備成FFPE細(xì)胞學(xué)蠟塊進(jìn)行后續(xù)分析。

② 腫瘤科醫(yī)師在申請(qǐng)胸水標(biāo)本的基因檢測(cè)時(shí)，必須同時(shí)進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)來(lái)進(jìn)行病理評(píng)估剩余液體冷藏/冷凍保存。體腔積液標(biāo)本可提取無(wú)細(xì)胞上清標(biāo)本中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測(cè)^[1],[3]。

用于突變基因檢測(cè)時(shí)，離心后得到的細(xì)胞塊樣本的保存方法與組織樣本相同^[6]。

腫瘤個(gè)體化治療基因檢測(cè)報(bào)告發(fā)出后的剩余樣本應(yīng)盡可能較長(zhǎng)期保存。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定樣本儲(chǔ)存制度對(duì)樣本進(jìn)行保存，建立樣本儲(chǔ)存的規(guī)章制度，做好樣本的標(biāo)識(shí)并按規(guī)定存放，保存好樣本的原始標(biāo)碼，建立配套的樣本存放信息管理系統(tǒng)。樣本的處理和相關(guān)材料的處理要符合《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》、《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》及國(guó)家、地區(qū)的相關(guān)要求^[6-7]。

圖4 用于保存樣本的-80℃冷凍冰箱示意圖

對(duì)于大型機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)，生物物樣本庫(kù)是樣本保存、重要科研成果快速產(chǎn)業(yè)化、成果應(yīng)用到臨床及實(shí)現(xiàn)“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”的重要保證。生物樣本庫(kù)主要是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲(chǔ)存和應(yīng)用生物體（健康/疾?。┑募?xì)胞、組織、血液、器官等樣本，以及與這些生物樣本相關(guān)的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用的系統(tǒng)。

自動(dòng)化樣本庫(kù)相對(duì)于傳統(tǒng)生物樣本庫(kù)模式（人工+冰箱）來(lái)說(shuō)，具有節(jié)能、存儲(chǔ)信息準(zhǔn)確、安全高效、信息化等優(yōu)勢(shì)。其在支撐精準(zhǔn)醫(yī)療、全民大健康、新型農(nóng)業(yè)、物種多樣性、海洋水產(chǎn)、微生物研究等領(lǐng)域發(fā)揮的作用不容小覷。

總結(jié)：

樣本獲取后質(zhì)量的評(píng)價(jià)對(duì)后續(xù)結(jié)果的解讀有重要意義，臨床樣本的采樣過(guò)程、分析前的運(yùn)輸和處理以及病理的評(píng)估結(jié)果等均應(yīng)做相應(yīng)的記錄。質(zhì)量評(píng)價(jià)的內(nèi)容應(yīng)包括腫瘤細(xì)胞含量比例、腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，是否按照要求進(jìn)行處理與運(yùn)輸?shù)?。評(píng)價(jià)方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察等。對(duì)于腫瘤細(xì)胞分布集中的區(qū)域應(yīng)進(jìn)行標(biāo)注，必要時(shí)進(jìn)行顯微切割后再提取核酸^[1]。