作者：簡川

一、肺炎支原體( Mycoplasma pneumoniae，MP) 是引起兒童時期肺炎或其他呼吸道感染的重要病原體之一。其中由MP為病原體所引起的最常見兒童疾病便是支原體肺炎（MycoPlasma Pneumoniae Pneumonia，MPP），占兒童肺炎的10%～20%，流行年份可達(dá)30%，且近幾年其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。

MP 感染的肺炎與其他呼吸道感染或細(xì)菌、病毒感染的治療方案與預(yù)防措施截然不同，并且MP感染具有起病隱匿、肺部體征輕、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查等常缺乏特異性等特點，給臨床診斷與治療帶來了極大的困難！

因此，及時、有效地進(jìn)行MP感染的檢驗與診斷，對指導(dǎo)臨床治療進(jìn)而預(yù)防可能發(fā)生的醫(yī)院內(nèi)流行和并發(fā)癥十分重要。

二、目前醫(yī)院相關(guān)檢驗科室對肺炎支原體的檢驗主要采用如下4種方法，分別是：

1、PCR熒光探針法( PCR fluorescence probing) ；

2、被動凝集法( passive particle agglutination) ；

3、間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence，IFA)

4、MP分離培養(yǎng)法。

掌握這4種常用MP感染的檢驗方法，使用這些方法對疑似MP感染患兒進(jìn)行檢驗與分析，最后便可以通過檢驗結(jié)果為臨床診斷支原體感染做出重要參考與診斷依據(jù)。

三、PCR熒光探針法( PCR fluorescence probing) 、被動凝集法( passive particle agglutination) 、間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence，IFA)和MP分離培養(yǎng)法這4種常用檢驗肺炎支原體感染方法的介紹與優(yōu)勢、劣勢分析。

1、PCR熒光探針法的基本原理介紹與優(yōu)點、缺點分析

PCR熒光探針法是指：PCR擴(kuò)增時，在加入一對擴(kuò)增引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。熒光探針為一段線性的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)（FAM或Hex等和一個熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，PCR儀檢測不到熒光信號；當(dāng)PCR擴(kuò)增時（在延伸階段），Taq酶的 5' -3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。這就是PCR熒光探針法的原理。

優(yōu)點主要集中于：1.檢驗人員可以利用不同探針，在一個體系中使用不同的熒光標(biāo)記同時檢測多種指標(biāo)，可達(dá)到節(jié)省成本的目的。2.探針法比起其他檢測方法來說還具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。3.由于PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步，以標(biāo)記特異性熒光探針為特點的熒光定量PCR技術(shù)不斷成熟，完全閉管式操作已經(jīng)逐漸普及，這樣就大大減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會，使其同時具備良好的靈敏度和特異性，并可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量。

缺點是：PCR法多采用吸痰方式來采集標(biāo)本，但是兒童咳痰能力較差、依從性也較差并且吸痰操作對醫(yī)務(wù)人員要求高，因此此法只適用于癥狀較重有吸痰需要的住院患兒，而對于癥狀較輕暫時沒有咳痰需求的患兒來說，此法就失去了使用價值。

2、被動凝集法的基本原理介紹與優(yōu)點、缺點分析

被動凝集法指采用被動凝集反應(yīng)（又稱間接凝集反應(yīng)）而產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象叫被動凝集法。其主要原理是用表面吸附MP抗原的明膠顆粒吸附于某種免疫無關(guān)的、適當(dāng)大小的微粒（載體微粒）表面，然后再與人血清中的MP抗體作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象。  

優(yōu)點為：1.操作簡單快速（采靜脈血清作為標(biāo)本即可）、設(shè)備要求低、結(jié)果判讀容易，過夜后再判讀不發(fā)生顯著變化。2.消除紅細(xì)胞載體引起的非特異性凝集。3.特異性、靈敏性較高。4.血清MP抗體滴度與MP感染者病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

缺點主要集中于：1.被動凝集法所采用的被動凝集反應(yīng)僅用于檢測MP抗體，而非直接檢測肺炎支原體（MP），因此其陽性結(jié)果并不能確診是MP感染。2.同時，其檢測結(jié)果若呈陰性也并不代表患兒沒有感染MP，只能說明此時沒有產(chǎn)生MP抗體，因此會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3、間接免疫熒光法(IFA)的基本原理介紹與優(yōu)點、缺點分析

間接免疫熒光法(IFA)的原理:用特異性的抗體與切片中的抗原結(jié)合后，繼續(xù)用間接熒光抗體即熒光二抗FITC，與前面的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原抗體熒光復(fù)合物，在熒光顯微鏡下觀察特異的熒光。簡單點說就是將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。此法常用于細(xì)面、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。

優(yōu)點是：方法簡便、特異性高，非特導(dǎo)性熒光染色少。

缺點是1、敏感性偏低。2、每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體，故其成本高且費時、費力。

4、MP分離培養(yǎng)法的基本原理介紹與優(yōu)點、缺點分析

因為支原體常侵及人的粘膜表面，一般可用棉花拭子在患者粘膜表面涂抹取樣后放入2~3ml支原體液體培養(yǎng)基的小管中，或取其分泌液，若標(biāo)本是組織塊，可在滅菌乳缽或玻璃勻漿后接種，取樣后以最快的速度放入肺炎支原體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)3~4天后，培養(yǎng)基中長出長出典型菌落，呈"油煎蛋"狀且邊緣不整齊時，可判斷此病原體為支原體。

優(yōu)點時顯而易見的：MP的分離培養(yǎng)和鑒定可客觀反映MP感染的存在，作為傳統(tǒng)的檢測手段，至今仍是支原體鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。

缺點更是致命的：1.費時并且費力，MP對培養(yǎng)條件要求苛刻，生長緩慢，做出判定需3~4周。當(dāng)標(biāo)本中 MP 數(shù)量極少、培養(yǎng)基營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)不夠或操作不當(dāng)時，均會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

四、通過正確、操作無失誤的情況下，收集大量臨床檢驗數(shù)據(jù)與治療MP感染的支原體肺炎患兒的病程記錄，直至治愈，并且在治療過程中以MP分離培養(yǎng)法為佐證。

發(fā)現(xiàn)：494例受檢患兒中，PCR熒光探針法陽性299例，陽性率60. 53%；被動凝集法陽性290例，陽性率58. 70% ; 間接免疫熒光法陽性242例，陽性率48. 99%。

注：1、被動凝集法將血清抗體滴度≥40作為血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2、未采用MP分離培養(yǎng)法參與比較的原因是：由于檢驗與判斷時間太久，雖為支原體診斷金標(biāo)準(zhǔn)但其缺點更為致命，在短期確診患兒“支原體感染”上和其他3種檢驗方法無比較意義。

五、因此可以看出PCR熒光探針法和被動凝集法在檢驗肺炎支原體感染上有一定優(yōu)勢。同時在這兩種檢驗肺炎支原體感染的操作方法上也各有優(yōu)劣，PCR熒光探針法所采取的樣本為患兒痰液，而被動凝集法所采取的樣本為患兒靜脈血。比較采取痰液和靜脈血這兩種方法，一般采取患兒靜脈血較易。

綜上所述：

目前國內(nèi)常見的 MP 感染檢驗方法包括培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和PCR方法。由于培養(yǎng)法的局限性，臨床并不常用，故臨床應(yīng)結(jié)合血清學(xué)和PCR方法的優(yōu)缺點，聯(lián)合用于臨床診斷。若血清學(xué)檢測陰性而PCR陽性，可能血清學(xué)檢查時間過早，患者體內(nèi)抗體尚未產(chǎn)生，甚至部分患者不能產(chǎn)生抗體; 當(dāng)血清學(xué)方法陽性而PCR陰性時，須考慮近期是否已發(fā)生過支原體感染以及血清學(xué)檢測假陽性的可能。

總之，這便給了檢驗科對可疑“肺炎支原體感染”的患兒做實驗室輔助診斷時給出了思路：在診斷 MP感染時，可將被動凝集法作為MP感染的病原學(xué)篩查項目，將PCR方法作為補充，并結(jié)合臨床癥狀和治療效果綜合判斷，為臨床醫(yī)師爭取在最短時間內(nèi)做出相應(yīng)診療措施治療患者貢獻(xiàn)出檢驗科的一份力量。

本文為醫(yī)家小二首發(fā)，作者：簡川  如人飲水，冷暖自知，轉(zhuǎn)載需獲授權(quán)。