 三十多年前，mRNA核酸疫苗的設(shè)想就已經(jīng)誕生。2020年新冠疫情的大流行促成了歷史上最快速的疫苗開發(fā)，也讓mRNA疫苗走到了聚光燈下，人們開始期望希望能生產(chǎn)出安全、多功能、易于生產(chǎn)的mRNA疫苗，應(yīng)用到更多疾病領(lǐng)域。 近日，Nature Reviews | Drug Discovery上發(fā)表了一篇名為“mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation”的綜述，簡述了mRNA疫苗在傳染病領(lǐng)域的技術(shù)基礎(chǔ)、遞送系統(tǒng)和臨床轉(zhuǎn)化，展示了mRNA疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀。 mRNA設(shè)計與合成的原理 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的mRNA可模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu)，包括五個部分：5’端帽，5’端UTR，一個編碼抗原的開放閱讀框，3?端UTR和3’末端polyA尾。  自擴增的IVT mRNA還可包括病毒來源的復(fù)制酶基因，能編碼RNA依賴的RNA聚合酶，從而增強mRNA在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，使mRNA在低劑量也可大量表達(dá)抗原。 5’端帽結(jié)構(gòu)與天然真核mRNA相同，可以阻止病毒RNA細(xì)胞質(zhì)傳感器的識別，此外，還可以保護mRNA不被外切酶降解，并與3’末端的polyA尾、polyA結(jié)合蛋白和翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，使mRNA環(huán)狀化并募集核糖體以啟動翻譯。 PolyA尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和半衰期，polyA尾結(jié)合蛋白形成復(fù)合物是啟動mRNA翻譯的必要條件。編碼區(qū)兩側(cè)的5'和3'UTR調(diào)控mRNA的翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位。 mRNA疫苗的開放閱讀框是最關(guān)鍵的組成部分，因為它包含翻譯成蛋白質(zhì)的編碼序列，可以在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下，通過將很少使用的密碼子替換為編碼相同氨基酸殘基的、更經(jīng)常使用的密碼子來優(yōu)化mRNA翻譯。 為了最大化mRNA的翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷，特別是修飾尿苷，阻止了模式識別受體的識別，保證了翻譯過程可以產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)。 除了對mRNA序列的改進，在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進展。例如，臨床上使用的合成mRNA是從DNA質(zhì)粒中利用噬菌體RNA聚合酶T7(也可以使用T3和SP6聚合酶)體外轉(zhuǎn)錄而得的，可去除雙鏈RNA(dsRNA)污染物、反應(yīng)物和不完整的轉(zhuǎn)錄本。其他方法包括使用來自牛痘病毒的capping和2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶進行反應(yīng)等，簡化了純化步驟。 mRNA的遞送載體 由于mRNA質(zhì)量較大（104-106Da），并帶有負(fù)電荷，因此不能通過細(xì)胞膜的陰離子脂質(zhì)雙分子層。此外，在體內(nèi)，它會被固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬，并被核酸酶降解。在培養(yǎng)皿中進行細(xì)胞內(nèi)mRNA遞送的方法有電穿孔、基因槍和體外轉(zhuǎn)染等，但體內(nèi)遞送mRNA則需要使用能夠在轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞的同時不引起額外免疫毒性的遞送載體。 脂質(zhì)納米顆粒（Lipid-based nanoparticles，LNPs） 脂質(zhì)納米顆粒是目前最多臨床應(yīng)用的mRNA遞送載體。截止2021年6月，所有正在開發(fā)或批準(zhǔn)臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用脂質(zhì)納米顆粒。LNPs作為mRNA遞送載體有許多優(yōu)點，包括易于配方、可模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷能力等。 除了RNA藥物之外，LNPs通常還包括四種成分：一種可電離的脂質(zhì)，膽固醇，一種輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì)，它們一起包裹和保護脆弱的mRNA核心。 陽離子脂類DOTMA及其合成類似物DOTAP是1989年第一個傳遞mRNA的脂類。它們的帶正電荷的胺有利于包裹帶負(fù)電荷的RNA。但是這種脂類會引發(fā)促凋亡和促炎癥反應(yīng)毒性。 為克服這種安全問題，研究人員開發(fā)了可離子化脂類（如DODAP和DODMA）。這些脂質(zhì)在生理pH值下被注入血流時是中性的，安全性優(yōu)于陽離子脂質(zhì)，并延長了藥物循環(huán)時間。可離子化脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質(zhì)帶正電并吸引RNA。此外，它們在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電，這促進了它們與內(nèi)涵體膜的融合，使它們能被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。 除可離子化脂質(zhì)外，其他三種脂質(zhì)成分也促進了納米顆粒的形成和功能。膽固醇通過填充脂質(zhì)之間的空隙來增強納米顆粒的穩(wěn)定性，并且在內(nèi)吞的過程中幫助與內(nèi)體膜融合。輔助性脂質(zhì)通過促進脂質(zhì)相變來調(diào)節(jié)納米顆粒流動性并增強效率，同時也影響靶器官的特異性。 聚乙二醇化脂質(zhì)組分則由聚乙二醇(PEG)與錨定脂質(zhì)如DMPE或DMG結(jié)合而成。親水PEG穩(wěn)定LNP，通過限制脂質(zhì)融合來調(diào)節(jié)納米顆粒的大小，通過減少與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用來增加納米顆粒的半衰期。針對新冠肺炎的mRNA-1273和BNT162b2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì)。 共聚物和聚合物納米顆粒 盡管不及LNPs的臨床案列，聚合物擁有和脂質(zhì)體相似的mRNA遞送效率和優(yōu)勢。陽離子聚合物可將核酸濃縮形成各種形狀和大小的多聚物，并通過內(nèi)吞作用將其遞送到細(xì)胞中。 聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸遞送聚合物，雖然功效極佳，但由于電荷密度高導(dǎo)致的毒性限制了它的應(yīng)用。通過應(yīng)用低分子形式，加入PEG，鏈接環(huán)糊精或二硫鍵等方法可以有效減低PEI的毒性。 此外，研究人員還開發(fā)了幾種毒性較小的生物可降解聚合物，例如聚β-氨基酯、聚氨基胺、聚天冬酰胺等。例如，帶有乙二胺側(cè)鏈的聚乙二醇化的聚(天冬酰胺)可將mRNA遞送至肝臟，大腦，脊髓，膝關(guān)節(jié)和嗅覺神經(jīng)。 其他 除上述兩種載體外，多肽也可以將mRNA遞送到細(xì)胞中，其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或兩親胺基團(例如精氨酸)，可以通過靜電結(jié)合mRNA并形成納米復(fù)合物。例如細(xì)胞穿透肽產(chǎn)品PepFect14，可在異種移植小鼠模型中將mRNA傳遞給卵巢癌細(xì)胞。與mRNA結(jié)合的魚精蛋白可以激活Toll樣受體(TLR7、TLR8)通路，識別單鏈mRNA，CureVac就正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗。 以角鯊烯為基礎(chǔ)的陽離子納米乳也能遞送mRNA。一些角鯊烯配方，如諾華的MF59，在FDA批準(zhǔn)的流感疫苗中作為佐劑。 mRNA疫苗治療傳染性疾病的研究進展 新型冠狀病毒 大多數(shù)SARS-CoV-2候選疫苗的原理是誘導(dǎo)對病毒表面刺突蛋白的免疫反應(yīng)。刺突蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2結(jié)合后，附著的刺突蛋白被細(xì)胞的跨膜絲氨酸蛋白酶2切割開，誘導(dǎo)構(gòu)象變化，暴露刺突蛋白的融合肽，促進其與細(xì)胞或內(nèi)體膜的融合。 截至2021年6月18日，已有185種COVID-19候選疫苗處于臨床前開發(fā)階段，另有102種疫苗進入臨床試驗，其中19種是mRNA疫苗。 2020年12月11日，輝瑞/BioNTech的疫苗BNT162b2獲得了FDA緊急授權(quán)，成為首個獲批的mRNA藥物。一周后，Moderna的mRNA-1273也獲準(zhǔn)在美國使用。輝瑞和BioNTech共同開發(fā)了5種編碼突刺蛋白抗原變體的mRNA疫苗候選產(chǎn)品。其主打產(chǎn)品為BNT162b1和BNT162b2，其中所有尿苷都被N1-甲基偽尿苷取代，以增強mRNA翻譯。BNT162b1編碼刺突蛋白受體結(jié)合域的三聚體分泌型，而BNT162b2編碼全長SARS-CoV-2刺突糖蛋白，在S2亞基上有兩個脯氨酸替換，這將蛋白鎖定在其融合前構(gòu)象。 在國內(nèi)，復(fù)星醫(yī)藥“復(fù)必泰”的審批也已進入行政審批階段。此外還有沃森生物/艾博生物研發(fā)的ARCoV、斯微生物的mRNA疫苗和艾美疫苗/麗凡達(dá)生物的候選產(chǎn)品進入了臨床階段。 流感 流感病毒變異體較多，且傳統(tǒng)流感疫苗是在雞蛋中培養(yǎng)的滅活流感病毒，生產(chǎn)時間長，純化困難。因此，確實需要替代抗原靶點和生產(chǎn)方法。體外轉(zhuǎn)錄的合成mrna可以滿足這一需求，并確保在出現(xiàn)全新流感毒株時快速生產(chǎn)疫苗。 2013年，一種基于LNP的自擴增mRNA疫苗在中國H7N9爆發(fā)后8天內(nèi)迅速研制成功，但由于沒有GMP生產(chǎn)的條件，未進入1期臨床階段。目前研究人員還在努力研制一種不需要每年修改的通用流感疫苗，可提供對幾種流感毒株(異源免疫)和亞型(異亞型免疫)的免疫。幾種載體(DLinDMA、DOTAP、聚亞胺和陽離子納米乳劑)、替代mRNA技術(shù)(核苷修飾mRNA和自擴增mRNA)和替代抗原靶點均已被用于mRNA流感疫苗。 不易發(fā)生突變的血凝素柄區(qū)最近已成為新的通用疫苗靶點。2021年6月22日，賽諾菲的疫苗全球業(yè)務(wù)部門賽諾菲巴斯德和Translate Bio合作啟動了一項評估m(xù)RNA疫苗治療季節(jié)性流感的1期臨床試驗。兩家公司將在該1期臨床試驗中中評估兩種疫苗配方（MRT5400和MRT5401）。 寨卡病毒和登革熱 所有的寨卡病毒感染都是由單一的血清型引起的，這表明接種任何一種病毒的抗原都可以預(yù)防所有的寨卡病毒。 膜和包膜蛋白(prM-E)是抗寨卡病毒mRNA疫苗常見的抗原選擇，抗prM-E的中和抗體可以防止病毒融合。一項研究顯示，單劑30μg或50μgLNP核苷修飾的prM-E mRNA疫苗產(chǎn)生的中和抗體滴度比純化滅活病毒和DNA疫苗在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體滴度高50-100倍，比1mgDNA疫苗在獼猴體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體滴度高50倍。 登革病毒與寨卡病毒來自同一病毒家族，它們的包膜蛋白有54-59%的氨基酸序列重疊。因此，寨卡疫苗編碼的包膜蛋白抗原可能刺激抗體的產(chǎn)生，這些抗體與登革熱包膜蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。 一項1期試驗的中期結(jié)果表明，Moderna的mRNA-1893疫苗在10μg和30μg劑量組可誘導(dǎo)94-100%的血清轉(zhuǎn)化，并且耐受性良好。另一項研究采用被動免疫方法，使用基于角鯊烯的納米載體傳遞中和ZIKV-117單克隆抗體(mAbs)的mRNA，表明mRNA編碼的中和單克隆抗體可能具有預(yù)防和治療活性。 HIV 在全球范圍內(nèi)，艾滋病毒目前影響著3800萬人，預(yù)計到2030年將影響多達(dá)4200萬人，但目前仍然沒有開發(fā)出有效的疫苗。這主要是由于HIV包膜蛋白具有顯著的抗原多樣性和密集的“聚糖屏蔽”（glycan shield）能力，能隱藏關(guān)鍵的包膜蛋白抗原表位。 目前已有一些臨床前研究使用多種載體遞送編碼HIV蛋白的mRNA疫苗，包括陽離子納米乳劑、DOTAP/DOPE脂質(zhì)體、聚合物和可離子化LNPs。這些研究表明，除了有效的載體外，必須開發(fā)新抗原以有效地靶向HIV。 一種新的艾滋病毒疫苗接種策略是從能中和幾種艾滋病毒毒株的感染者體內(nèi)分離廣譜中和單克隆抗體。近期，廣譜中和單克隆抗體VRC01最近受到了關(guān)注，因為它們能夠中和98%的HIV毒株，防止抗體敏感毒株傳播的有效性達(dá)到75.4%。在一項研究中，其mRNA產(chǎn)品經(jīng)LNP封裝、核苷修飾以表達(dá)VRC01，靜脈注射劑量為單次0.7mg/kg，最終產(chǎn)生的抗體濃度與注射一劑10-20mg/kg的mAb蛋白通常產(chǎn)生的抗體濃度相似，可以保護小鼠免受靜脈注射HIV-1的影響。 呼吸道合胞體病毒（Respiratory syncytial virus ，RSV） 呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因，每年造成約60000名5歲以下兒童、14000多名65歲以上老年人死亡。 1968年，一種福爾馬林滅活的RSV候選疫苗引起了兒童的疫苗相關(guān)增強疾病（VAED）。VAED會使肺部嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞過度浸潤，導(dǎo)致80%的接種兒童發(fā)生嚴(yán)重毛細(xì)支氣管炎或肺炎，造成2例死亡。 目前的RSV候選疫苗主要針對有助于病毒融合且高度保守的F蛋白。盡管一些候選疫苗由于中和抗體滴度不足，臨床試驗宣告失敗，但對F蛋白構(gòu)象的新發(fā)現(xiàn)揭示了針對預(yù)融合構(gòu)象的疫苗能誘導(dǎo)出更好的中和抗體反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)有望改善未來的疫苗設(shè)計。 mRNA疫苗可以通過工程編碼序列來編碼穩(wěn)定的F蛋白構(gòu)象。在多個臨床前研究中，編碼天然RSV F蛋白或穩(wěn)定預(yù)融合構(gòu)象的mRNA疫苗均可以使用陽離子納米乳劑和LNPs作為載體成功遞送，沒有觀察到任何VAED實例。 Moderna正在評估三種編碼預(yù)融合F蛋白的單劑量候選疫苗：用于成人的mRNA-1172（使用默克公司專有LNPs）、mrna-1777（使用Moderna專有LNPs），以及用于兒童的mRNA-1345（使用Moderna專有LNPs）。 在1期臨床試驗中，mRNA-1777與RSV中和抗體引發(fā)了強大的體液反應(yīng)，CD4+ T細(xì)胞對RSV F肽產(chǎn)生了反應(yīng)，且沒有嚴(yán)重的不良事件。1期中期數(shù)據(jù)表明，100μg劑量的mRNA-1345在接種1個月后產(chǎn)生的中和抗體滴度大約是mRNA-1777的8倍。Moderna的目標(biāo)是將mRNA-1345與其兒科人偏肺病毒/副流感病毒3型（hMPV/PIV3）候選疫苗產(chǎn)品mRNA-1653整合在一起，并作為一種單獨配方為兒童接種針對三種不同病原體的疫苗。 埃博拉病毒（EBOV） 2014-2016年西非爆發(fā)的埃博拉疫情奪走了11000多條生命。2019年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一種基于重組水皰性口炎病毒(VSV)的埃博拉疫苗(rVSV-EBOV)。盡管與沒有接種疫苗相比，rVSV- EBOV在預(yù)防埃博拉傳播方面的有效性為97.5%，但臨床試驗中顯示出一些安全性問題。 針對EBOV的mRNA疫苗可能比這種基于病毒的疫苗更安全，因為它們不會在體內(nèi)復(fù)制。一種mRNA疫苗已在小鼠中證明了其有效性，該疫苗將未經(jīng)修飾的、自擴增的編碼EBOV糖蛋白的mRNA傳遞到聚(氨基胺)樹狀聚合物納米顆粒中。該疫苗可誘導(dǎo)CD8+和CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生糖蛋白特異性IgG抗體，并產(chǎn)生高表達(dá)的IFNγ和IL-2，兩種劑量方案(兩劑4μg或一劑40μg)均可保護小鼠免受死亡。另一項研究使用LNP封裝、核苷修飾的編碼EBOV糖蛋白的mRNA，以兩次20μg的劑量接種至豚鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生高抗體滴度，保護動物免受病毒的致命攻擊。 狂犬病毒 盡管狂犬病疫苗已獲批準(zhǔn)，但每年仍有超過5萬人死于狂犬病。為了滿足這一需求，CureVac已經(jīng)部署了其RNActive平臺，在其狂犬病候選基因CV7201中遞送編碼狂犬病毒糖蛋白的未經(jīng)修飾的mRNA。 在小鼠和豬的模型中，需間隔21天接種兩劑80μg的疫苗，可誘導(dǎo)高中和抗體滴度，并引起抗原特異性CD4+和CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答。其1期試驗終期測試了不同給藥途徑(真皮內(nèi)或肌肉內(nèi))和不同給藥裝置(標(biāo)準(zhǔn)注射器或無針皮內(nèi)注射器)的效果。有趣的是，盡管給藥途徑不影響免疫反應(yīng)，但給藥裝置卻影響了免疫反應(yīng)，只有皮內(nèi)注射器產(chǎn)生了短暫的體液反應(yīng)。給藥效力弱，加之不良事件發(fā)生率高，這表明CureVac需要進一步優(yōu)化給藥平臺。 隨后，CureVac使用由Acuitas Therapeutics公司生產(chǎn)的專有LNPs作為其新型狂犬病候選藥物CV7202的遞送載體。在一項臨床前研究中，CV7202遞送未經(jīng)修飾的編碼狂犬病病毒糖蛋白的mRNA，并產(chǎn)生強大的抗體和CD8+和CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答。在非人類靈長類動物中，受試動物間隔28天注射兩次100μg劑量狂犬病疫苗，結(jié)果顯示具有良好的耐受性，其抗體滴度比商業(yè)許可的狂犬病疫苗高20倍。其1期研究結(jié)果表明，兩劑1μg劑量的疫苗就能產(chǎn)生較高的中和滴度和較強的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，且耐受性良好。 瘧疾 瘧疾是由瘧原蟲屬的單細(xì)胞真核寄生蟲引起的，其發(fā)病率和致死率位居榜首。目前，人體對瘧原蟲感染的自然免疫反應(yīng)已經(jīng)確定了潛在的非表面抗原靶點。例如，瘧原蟲分泌的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(PMIF)已經(jīng)被證明可以阻止T細(xì)胞形成長期記憶。 在這一發(fā)現(xiàn)之后，研究人員用角鯊烯為基礎(chǔ)的陽離子納米乳劑作為載體，來遞送編碼PMIF的自擴增mRNA，研制出了疫苗。兩種15μg引物增強劑可改善輔助T細(xì)胞的發(fā)育，并誘導(dǎo)抗瘧疾IgG抗體和記憶T細(xì)胞反應(yīng)。此外，從接種過疫苗的小鼠身上過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞可以保護未接種過疫苗的小鼠免受瘧原蟲孢子體的傷害。 mRNA疫苗目前面對的挑戰(zhàn) 原則上，mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有幾個優(yōu)勢。
 mRNA疫苗通過轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞引起免疫  
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