寫在前面：

本次更新主要介紹實驗過程中或許會常碰到的小疑問。

1.什么時候用NF水，什么時候用TE，二者可以混著用嗎？

   NF水，即Nuclear Free Water，不含核酸酶的水。Nuclease-free Water (not DEPC-treated) has been deionized, filtered into the final bottle, and autoclaved。這個是參考Thermo Fisher產品介紹即去離子、過濾后經高壓滅菌的水。

   TE，即Tris+EDTA緩沖液，pH=8.0，經常用到的是1X TE緩沖液， 能穩(wěn)定儲存核酸。

    由于EDTA是一種可以和Mg、Ca、Mn、Fe等二價金屬離子結合的螯合劑 ，而在PCR中常常用到二價鎂離子，所以在做PCR時要用NF水盡量不要用TE洗脫DNA；當我們文庫構建完成后，常常用TE緩沖液穩(wěn)定保存核酸，當然這一步用NF水也沒有多大影響。

2.磁珠使用前為什么要進行室溫平衡？

   磁珠吸附DNA純化的原理是固相載體固定可逆化（Solid-Phase Reversible Immobilization，SPRI） 技術，簡單的說就是磁珠能在聚乙二醇（PEG）和鹽離子的作用下可逆的結合DNA[1]。那磁珠為什么要進行室溫平衡？引用其他帖子的回答“PEG的DNA沉聚效果容易受到pH、溫度等的影響，溫度過低PEG也不易與水完全互溶，所以磁珠一般都要求室溫平衡后再用”[2]，小編查閱了相關文獻并沒有說一定要在室溫，甚至有研究直接在0℃用PEG沉淀DNA，不過用時12h，分子量小的片段用時會相對少一些，而且在0℃和20℃的沉降效率相同[3]，所以提前平衡至室溫也可能跟縮短孵育時間有關。另外磁珠是不能在-20℃保存的，冷凍會影響磁珠的捕獲效率。

3.為何末端修復、接頭連接以及PCR體系的預混液要在冰盒上操作？

   當多個樣本一起操作時，經常會進行各步驟預混液的配制，這樣的作用不僅可以提高操作速度，同時可以消除單獨加試劑產生的差異性。

    在冰盒上操作的主要作用就是保持各步驟酶的活性，避免修復/連接/擴增效率降低。

4.為什么純化過程用的是80%的無水乙醇？

    80%無水乙醇主要作用是洗掉鹽粒子等雜質。我們之前都學過低濃度（約小于20%）酒精可以溶解DNA，但高濃度（大于70%）的酒精是不會溶解DNA的，所以常常用高濃度的酒精純化DNA。但是高濃度的話容易揮發(fā)而導致濃度下降，另外無水乙醇的純度是比工業(yè)酒精（95%）高，所以常常用到的是新鮮配制的80%無水乙醇。

5.接頭連接體系預混液配制好之后可以先加接頭進去嗎？

   不行。如果提前把接頭加到接頭連接預混液中，會導致接頭發(fā)生自連，從而消耗接頭和連接試劑，使得接頭和末端修復產物的連接效率降低，最后文庫濃度偏低或者不合格。

6.樣本片段化時怎么選擇打斷程序or酶切時間？

   在確定一個樣本的打斷程序or酶切時間之前要明確該樣本的質量，主要是跑膠看其完整性，一般基因組DNA（genomic DNA，gDNA）因其基因組片段較完整，所以一般打斷功率和時長都會較長，or酶切時間也是相對較長。而針對福爾馬林固定石蠟包埋的樣本（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE），由于該樣本存在不同程度的降解，根據降解程度一般都會將相差不太大的劃分為一個等級，通過跑膠確定其等級之后，可以優(yōu)化調整打斷功率和時間or酶切時間進行片段化。

    在沒有形成片段化的體系之前，建議先優(yōu)化出不同等級的樣本片段化方案，結合片段分析儀器（Agilent 2100 or Qseq 100等）找到目標片段大小時對應的打斷程序or酶切時間即可。

    小編之前也在Covaris 超聲打斷儀上優(yōu)化過FFPE的打斷程序，主要根據你設置的Peak Incident Power（PIP）*Duty Factor = Average Power & Duration有關。

7.片段篩選時為什么磁珠的體積要比DNA的??？

   因為片段篩選的主要作用是篩選出接頭連接成功的片段，會篩掉一些其他的沒消耗完的試劑等雜質，也會去掉沒有連接上的接頭，主要原因就是，當磁珠體積小于DNA的時，此時磁珠主要是結合DNA相對較大的片段，所以此時磁珠的體積要比DNA的小（一般DNA：磁珠=1:0.75左右，參考Q8)，從而達到片段篩選的目的。

8.磁珠分選不同片段大小DNA的主要原理是什么？

   在磁珠分選不同片段大小的DNA時，根據較大的DNA片段更容易與磁珠沉淀的原理，所以當使用磁珠量較少時，磁珠捕獲到的DNA片段相對較大，隨著磁珠量增加，磁珠捕獲到的DNA片段則越來越涵蓋相對較小的片段。具體如下圖1：

    圖1 引自參考文獻4 Fig 2A。從上到下，DNA片段是從大到小；從左到右，隨著磁珠量的減少，捕獲到的小的DNA片段越來越少。

9.純化時棄上清的過程中怎樣避免吸到磁珠？

   首先可以適當延長在磁力架上靜置的時間（如果實驗允許的情況下）；其次在用單槍或者排槍吸上清的時候，盡量緩慢勻速的吸，也可以盡量避免吸到磁珠；當然也可以采用大小槍頭套用或者換用的方法，套用就是在大槍頭下套一個小槍頭，換用就是先用大槍頭吸取一部分，再換小槍頭吸掉剩余的。

10.末端修復和接頭連接的預混液加反了怎么辦？

     如果在末端修復的過程中發(fā)現加了接頭連接的預混液，則可以停止實驗，做磁珠純化后再重新配制末端修復試劑后重新進行末端修復實驗，也可以直接65攝氏度加熱30min，使得酶活性消失，再加末端修復試劑重新進行末端修復實驗，后需注意片段篩選時體積變化即可（只是建議參考）。

11.如何確定PCR的循環(huán)數？

    文庫構建為了獲得較多的滿足后續(xù)雜交需求的文庫濃度，常常會進行PCR擴增，合適的PCR循環(huán)數不僅可以得到相對較好豐度的文庫濃度，方便后續(xù)多文庫的雜交操作，還能降低測序過程中的重復率，節(jié)約測序成本。

     因為不同樣本核酸濃度不同，當文庫構建時樣本核酸的投入量一樣時（eg：200ng），只需結合文庫濃度和測序重復率優(yōu)化出合適的PCR循環(huán)數即可，當投入量較低時（不能低于最低要求），為了獲得合格的文庫濃度，則需相應增加PCR循環(huán)數。

12.文庫構建完成后發(fā)現文庫濃度偏低是什么原因？

    因為文庫構建涉及的步驟繁多，每一步操作失誤都會在最后測定文庫濃度和質量的時候表現出來。所以操作過程中要認真，仔細。如果文庫構建完成后是所有樣本的文庫濃度都低，那可能是之前的步驟（片段化、末端修復、接頭連接、片段篩選、PCR）出問題，甚至不排除試劑出問題的可能，如果一定要找原因的話，可以先把片段化的中間產物跑Agilent 2100 or Qseq 100看片段大小范圍，判斷是否跟打斷有關，還可以把文庫再加PCR預混業(yè)進行PCR，可以判斷是否跟PCR有關；如果是部分樣本文庫濃度較低，也可能跟操作有關，但很可能是跟該樣本自身的質量有關系。

下期預告：

下一期打算主要寫一寫上機測序知多少。

今天來個小插曲→ 實驗室的故事2（分享一個面試學到的知識點，主要也跟遺傳腫瘤檢測相關，后邊小編也查了這個問題相關的文獻。）

為什么cfDNA片段大小主要在170bp左右？

     首先明確cfDNA、ctDNA的概念，cfDNA即circulating free DNA；ctDNA即circulating tumor DNA。   

       在細胞凋亡或壞死的細胞死亡會導致原生染色質接近完全消化，蛋白質結合的dna片段，通常與組蛋白或轉錄因子（Transcription Factors TFs）相關，優(yōu)先在消化中存活下來，并被釋放到血液循環(huán)中，蛋白酶處理后可從外周血漿中回收碎片[5]。

      核小體是有146bpDNA纏繞的組蛋白八聚體，每個核小體之間為50bp左右的DNA連接[6]，一般DNA在兩個核小體連接處發(fā)生斷裂，故cfDNA片段大小主要在170bp左右。如下圖2：

      當然我們在跑片段分析時，發(fā)現cfDNA在360bp附近也有一個很小的峰，這個斷裂后剩下兩個核小體所致。所以我們構建血漿cfDNA的文庫后質檢發(fā)現經常會出現兩個主要的峰，因為加了接頭，所以文庫濃度峰會在300bp & 500bp 左右。如下圖3：

圖3  cfDNA 文庫片段范圍，因為加了接頭，所以文庫濃度峰會在300bp & 500bp 左右了。

如果有想獲取參考文獻的童鞋，可以大膽的私信我。

下期再見！記得給小編打call、點關注。

參考文獻：

[1]DeAngelis MM, Wang DG, Hawkins TL. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 25;23(22):4742-3. doi: 10.1093/nar/23.22.4742. PMID: 8524672; PMCID: PMC307455.

[2]https://zhuanlan.zhihu.com/p/148423335

[3]Lis JT. Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation. Methods Enzymol. 1980;65(1):347-53. doi: 10.1016/s0076-6879(80)65044-7. PMID: 6246357.

[4]Oberacker P, Stepper P, Bond DM, H?hn S, Focken J, Meyer V, Schelle L, Sugrue VJ, Jeunen GJ, Moser T, Hore SR, von Meyenn F, Hipp K, Hore TA, Jurkowski TP. Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation. PLoS Biol. 2019 Jan 10;17(1):e3000107. doi: 10.1371/journal.pbio.3000107. PMID: 30629605; PMCID: PMC6343928.

[5]Snyder MW, Kircher M, Hill AJ, Daza RM, Shendure J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):57-68. doi: 10.1016/j.cell.2015.11.050. PMID: 26771485; PMCID: PMC4715266.

[6]https://baike.baidu.com/item/%E6%A0%B8%E5%B0%8F%E4%BD%93/5491280?fr=aladdin