Introduction

線粒體是控制細(xì)胞生死的中央細(xì)胞器。它們參與關(guān)鍵的代謝反應(yīng)，合成大部分ATP，調(diào)控包括凋亡在內(nèi)的一系列信號級聯(lián)反應(yīng)。

在早期的核心生物能學(xué)中，人們熱衷于研究能量守恒的機制，線粒體研究得益于從組織中分離的細(xì)胞器的制備。這要歸功于George Palade及其同事的開創(chuàng)性工作，他們在20世紀(jì)40年代末開發(fā)了一種基于差異離心的分離線粒體的方案。他們建立在Bensley和Hoerr3的早期工作的基礎(chǔ)上，他們通過離心從冷凍解凍的豚鼠肝臟中分離出一種混合的膜狀碎片，這種碎片可能富含線粒體。Palade的直覺是，在機械均質(zhì)組織后，根據(jù)細(xì)胞的不同沉降特性，應(yīng)用差異離心來分離細(xì)胞成分。這種方法是對線粒體研究的一次真正的哥白尼式革命，允許高產(chǎn)分離純細(xì)胞器。結(jié)果，在接下來的20年里，我們看到了如此驚人的發(fā)現(xiàn):能源節(jié)約的機理;線粒體dna5,6的鑒定及線粒體前體蛋白導(dǎo)入的鑒定線粒體超微結(jié)構(gòu)的定義，隨著Palade模型的發(fā)展;最后但并非最不重要的是，發(fā)現(xiàn)了線粒體內(nèi)膜通道。

在線粒體離開生物醫(yī)學(xué)研究的中心階段近15年之后，在20世紀(jì)90年代，線粒體重新獲得了重大研究成果，因為發(fā)現(xiàn)它們通過釋放細(xì)胞色素c和其他膜間隙蛋白來放大細(xì)胞凋亡，而這些蛋白需要充分激活效應(yīng)caspases10,11。雖然線粒體在細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，但細(xì)胞色素c釋放的確切機制仍然是一個激烈爭論和研究的問題。此外，越來越多的證據(jù)表明該細(xì)胞器在多個病理生理過程中的作用，包括神經(jīng)退化、神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、可塑性和不育。這些發(fā)現(xiàn)，加上新舊研究領(lǐng)域的結(jié)果，旨在闡明線粒體功能的基本生物學(xué)機制。從代謝物和離子的運輸，到蛋白質(zhì)導(dǎo)入的機制和蛋白質(zhì)的闡明，再到線粒體的動態(tài)行為，所有這些領(lǐng)域都從分離的、純細(xì)胞器的可用性中受益匪淺。

本協(xié)議描述了如何從肝臟、骨骼肌和培養(yǎng)細(xì)胞三種不同來源獲得功能性、純化、完整的線粒體。這些變異旨在作為例證，而不是詳盡無遺的，因為它們沒有涵蓋可以分離出線粒體的不同來源。例如，酵母細(xì)胞中線粒體的分離是根據(jù)這些低等真核生物的機械和滲透特性量身定制的。由于我們的目的是為不同的器官和培養(yǎng)的細(xì)胞提供一個總體框架，在任何情況下都可以由單個研究人員修改，嚴(yán)格遵循這些協(xié)議最適合于從所描述的組織和細(xì)胞中分離細(xì)胞器。然而，我們的經(jīng)驗表明，與成纖維細(xì)胞一起使用的方案可以不經(jīng)修飾而采用，從其他細(xì)胞系，如HeLa和前列腺癌細(xì)胞系LnCaP中分離線粒體。另一方面，將線粒體從肌肉和肝臟以外的器官中分離出來的方法與這里所描述的不同。因此，我們強烈建議讀者參考已發(fā)表的針對大腦、棕色脂肪組織和心臟的治療方案。

應(yīng)該強調(diào)的是，可用于分離線粒體的方案與我們的方案有些不同，特別是在差速離心步驟的速度和分離緩沖液中用作滲透壓調(diào)節(jié)劑的糖方面。根據(jù)我們的經(jīng)驗，沉降速度的微小變化(600與800g，7，000與8，000g)不會影響線粒體制劑的質(zhì)量和產(chǎn)量，但據(jù)報道，使用甘露醇等單糖可使分離的線粒體更好地偶聯(lián)23，24。根據(jù)我們的經(jīng)驗，使用甘露醇并未改善線粒體制劑的質(zhì)量。如果讀者發(fā)現(xiàn)使用我們的方案分離的線粒體的質(zhì)量或產(chǎn)量不令人滿意，建議嘗試用甘露醇等單糖替代蔗糖。線粒體分離的最終目標(biāo)是獲得盡可能純凈和有功能的細(xì)胞器。我們強烈建議，特別是如果將線粒體用于功能測定(如細(xì)胞色素c的釋放、線粒體融合、蛋白質(zhì)導(dǎo)入和活性氧的產(chǎn)生)，應(yīng)始終使用氧電極測量制劑的偶聯(lián)。因此，這些方案以如何測量線粒體呼吸以確定制劑質(zhì)量的描述結(jié)束。偶聯(lián)良好的線粒體是在旨在研究線粒體參與復(fù)雜生物現(xiàn)象機制的測定中獲得可靠、可再現(xiàn)結(jié)果的第一步。

總之，這些方案是從組織和細(xì)胞中獲得純線粒體的一個有價值的起點。然后，分離的線粒體可用于研究細(xì)胞器的功能、對凋亡刺激的反應(yīng)、細(xì)胞色素c釋放的特征、蛋白質(zhì)導(dǎo)入以及線粒體生物學(xué)和病理生理學(xué)中需要純細(xì)胞器和功能性細(xì)胞器來源的許多其他方面。

MATERIALS

REAGENTS

材料和試劑。

從小鼠中分離的目的細(xì)胞系或肝臟或肌肉。具有所需遺傳背景的小鼠(Charles River或Jackson Laboratories)。

不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，Invitrogen，cat. no. 14200-067)。

蔗糖(Sigma, cat. no. 84100)。

磷酸二氫鉀(Pi, Sigma, cat. no. P53799)。

sigma 7-9(Tris, Sigma, cat. no. T1378)。

4-嗎啉代丙磺酸(MOPS; Sigma, cat. no. M1254)。

乙二胺四乙酸二鈉二水合物(EDTA; Sigma,  cat. no. ED2SS)。

乙烯-雙(氧乙烯腈)四乙酸(EGTA; Sigma,  cat. no. E4378)。

氯化鉀(Baker, cat. no. 0208)。

氯化鎂六水合物(Sigma, cat. no. M9272)。

牛血清白蛋白(BSA)；BSA; Sigma, cat. no. A6003)。

Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen, cat. no. 11971025)。

200mM L-谷氨酰胺(Invitrogen, cat. no. 25030024)。

胎牛血清(Invitrogen, cat. no. 10270106)。

5，000 U·ml 1青霉素/5，000mg·ml 1鏈霉素(Invitrogen,  cat. no. 15070063)。

10 mM基本必需培養(yǎng)基非必需氨基酸溶液(Invitrogen, cat. no. 11140)。

0.25% (w/v)胰蛋白酶EDTA溶液(Invitrogen, cat. no. 25200072)。

腺苷5-二磷酸鈉鹽(ADP; Sigma, cat. no. A2754)。

羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯基腙(FCCP; Sigma,  cat. no. C2920)。

谷氨酸(Sigma, cat. no. 27647)。

蘋果酸(Sigma, cat. no. M1000)。

琥珀酸(Sigma, cat. no. S3674)。

魚藤酮(Sigma, cat. no. R8875)。

l-抗壞血酸(Sigma, cat. no. 255564)。

N，N，N，N-四甲基-對苯二胺二鹽酸鹽(TMPD; Sigma,  cat. no. T3134)。

抗霉素A(Sigma, cat. no. A8674)

EQUIPMENT

用于細(xì)胞培養(yǎng)的. 500 cm2培養(yǎng)皿(Nunclon, cat. no. 16 6508)。

18cm細(xì)胞刮除器(Falcon, cat. no. 353085)。

電機驅(qū)動的緊密配合玻璃/特氟隆波特埃爾維耶姆均質(zhì)機(圖1)。

克拉克型氧電極(Hansatech Oxygraph; Fig. 2)。

50 ml聚丙烯Falcon管。

14 ml聚丙烯Falcon管。

1.5 ml微量離心試管。

30 ml圓底玻璃離心管(Kimble, cat. no. 45500-30)。

離心管的橡膠適配器套管(Kimble, cat. no. 45500-15)。

冷藏離心機，含50 ml Falcon試管和玻璃離心試管。

Hamilton注射器:10 ml (Hamilton, cat. no. 701 N)和50 ml (Hamilton  cat. no. 705 N)

REAGENT SETUP

試劑的設(shè)置

細(xì)胞培養(yǎng)基使用為您喜愛的細(xì)胞系推薦的培養(yǎng)基。對于本方案中提及的細(xì)胞系，使用添加了10%(v/v)胎牛血清0.1 mM的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基基本必需培養(yǎng)基非必需氨基酸。分別為2mM L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素50 U ml-I和50 ug ml-I細(xì)胞進(jìn)行實驗前兩天或三天，將細(xì)胞置于500 cm組織培養(yǎng)皿中。每個平板使用70 ml細(xì)胞培養(yǎng)基

為了獲得高產(chǎn)的分離線粒體，確保細(xì)胞在培養(yǎng)皿上完全分散是至關(guān)重要的，在實驗當(dāng)天達(dá)到幾乎100%的匯合是至關(guān)重要的。

1 M蔗糖：將342.3 g蔗糖溶于1升蒸餾水中；充分混合并制備20毫升等分試樣；

0.1 M Tris/MOPS：將12.1 g Tris溶解在500 ml蒸餾水中，使用MOPS粉末將pH調(diào)至7.4，將溶液調(diào)至1升，在4 1C下儲存。

1 M Tris/HCl：將121.14 g Tris溶于500 ml蒸餾水中，用鹽酸將pH調(diào)至7.4;將溶液調(diào)至1升并在室溫下儲存。

0.1 M EGTA/Tris：將38.1 g EGTA溶解在500 ml蒸餾水中，用Tris粉將pH調(diào)至7.4，將溶液調(diào)至1升，在4 ℃下儲存。

0.5 M MgCl2：將101.7 g MgCl2溶于1升蒸餾水中，置于4 ℃下儲存。

1 M KCl：將74.6克氯化鉀溶解在1升蒸餾水中，并在4℃下儲存。

1 M EDTA：將372.2 g EDTA溶解在500 ml蒸餾水中，用Tris粉將pH調(diào)至7.4，將溶液調(diào)至1升，在4 ℃下儲存。

10% BSA：將10g BSA溶于100 ml蒸餾水中，并在-20 ℃儲存。

1 M Pi：將136.1克磷酸氫鉀溶解在500毫升蒸餾水中，用Tris粉調(diào)整pH至7.4，將溶液調(diào)至1升，在4 ℃下儲存

10 mM ADP：將4.7mg ADP溶于1 ml蒸餾水中。將酸堿度調(diào)節(jié)至7.4制備100 ml等分試樣，并在-20 ℃避光保存6個月。

20 mM FCCP：將5.1 mg FCCP溶解于1 ml無水乙醇中。溶液的顏色是淡黃色。存儲在-20 ℃。使用前，在2ml無水乙醇中加入10ul的20mM FCCP將原溶液稀釋至100uM。

圖1 | Glass/Teflon Potter Elvehjem均質(zhì)器。左邊的均質(zhì)器(5ml)最適合從細(xì)胞中分離線粒體，右邊的均質(zhì)器(30ml)更適合從組織中分離線粒體。

圖2 | 一個clark型氧電極連接到筆記本電腦和一個水浴。屏幕上的痕跡與拍攝照片時實驗運行的記錄相對應(yīng)。

0.25 M谷氨酸/0.125 M蘋果酸：將9.2 g谷氨酸和4.2 g蘋果酸溶解于100ml蒸餾水中。調(diào)整pH值至7。4 .用Tris堿實現(xiàn)鹽的完全溶解。加水至250毫升，準(zhǔn)備10毫升等量，在C中保存6個月。

0.5 M琥珀酸原液(100X)：將3.0 g琥珀酸溶解于30ml蒸餾水中。用Tris堿調(diào)整pH值，使鹽完全溶解。加水使體積達(dá)到50毫升，準(zhǔn)備10毫升等量，并在-20℃下保存6個月

2 mM魚藤酮原液：將4.7毫克魚藤酮溶于6毫升無水乙醇中。攪拌均勻，直至完全溶解。CRITICAL 魚藤酮在有機溶劑中暴露于光和空氣中分解氧化。原先透明的溶液變成褐色。必須使用鋁箔來保護(hù)原料溶液不受直接光線的照射。！ 謹(jǐn)慎魚藤酮劇毒:避免皮膚接觸和吸入。

600mM抗壞血酸原液：取5.2 g抗壞血酸溶于50 ml蒸餾水中，將pH值調(diào)節(jié)至7.4，并在-20℃儲存6個月。

30 mM TMPD庫存解決方案：取0.36g TMPD溶于50 ml蒸餾水中；調(diào)節(jié)酸堿度至7.4；在-20℃儲存6個月。由于該化合物被氧氣氧化，溶液呈深藍(lán)色。

25 mg ml-1抗霉素A貯備溶液：溶解50毫克抗霉素A于2 ml無水乙醇稀釋原溶液至25 ug ml-1，在2 ml無水乙醇中加入2 ul 25 mg ml-抗霉素A，就在使用之前。

！ 注意:抗霉素A具有高毒性，應(yīng)避免皮膚接觸和吸入。

細(xì)胞和小鼠肝臟線粒體分離(IBc)緩沖液：將10 ml 0.1 M Tris MOPS和1 ml EGTA/Tris加入到20 ml 1 M蔗糖中，制備100 ml IB。加入蒸餾水至100毫升。調(diào)整pH值至7.4。

肌線粒體分離緩沖液1 (IBm1)：將6.7 ml 1 M蔗糖、5 ml 1 M Tris/HCl、5 ml 1 M KCl、1 ml 1 M Tris/HCl混合，制備100 ml IBm1EDTA和2ml 10%牛血清白蛋白。調(diào)整pH值至7.4。加入蒸餾水至100毫升。

肌線粒體分離緩沖液2 (IBm2)：將25ml 1 M蔗糖、3ml 0.1 M EGTA/Tris和1ml 1 M Tris/混合，制備100ml IBm12鹽酸。調(diào)整pH值至7.4。加入蒸餾水至100毫升。

細(xì)胞和小鼠肝臟線粒體(EBc)實驗緩沖液：制備100ml EB c，混合1m KCl 12.5 ml, 1m Tris/MOPS 1 ml, 10ml 0.1 M EGTA/Tris和100ml Pi。調(diào)整pH值至7.4。加入蒸餾水至100毫升。

肌線粒體實驗緩沖液(EBm)：制備100ml EB m，加入1ml的1m Tris/HCl, 1ml的0.5 m MgCl2, 200ml的1m Pi和20ml的0.1 m EGTA/Tris到25ml的1m蔗糖。調(diào)整pH值至7.4。加入蒸餾水至100毫升。用雙蒸餾水清洗所有玻璃器皿三次，以避免Ca2+污染。Ca2+超載是孤立線粒體功能障礙的最常見原因。在實驗當(dāng)天準(zhǔn)備所有的緩沖液，以避免細(xì)菌/酵母在儲存的緩沖液中生長。由于pH值取決于溫度，在25℃下測量所有溶液的pH值。

圖3從MEFs中分離線粒體的時間。

PROCEDURE

1|線粒體可以從多種細(xì)胞或組織中分離出來。選項A描述了從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中分離線粒體(時間軸見圖3);選項B描述從小鼠肝臟中分離線粒體(時間軸見圖4);選項C描述了從小鼠骨骼肌中分離線粒體(時間軸見圖5)

(A)從MEFs中分離線粒體的時間約為2小時

(I)從細(xì)胞中取出培養(yǎng)基，并用pbs洗滌細(xì)胞一次

(ii)取出PBS，并用細(xì)胞刮器分離細(xì)胞。

(iii)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 ml聚丙烯Falcon管中

(iv)用PBS清洗培養(yǎng)皿一次，然后刮去培養(yǎng)皿以分離剩余的細(xì)胞。

(V)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到步驟3中定義的相同聚丙烯Falcon管中。根據(jù)我們的經(jīng)驗，播種120 x 106

實驗前2天每皿MEFs導(dǎo)致良好產(chǎn)量的線粒體(約3毫克線粒體蛋白)

(vi)將細(xì)胞在600g、4℃條件下離心10 min

(vii)丟棄上清液，并將細(xì)胞重新懸浮在3 ml冰冷卻的IB溶液中IBc

(viii)使用1 600轉(zhuǎn)/分的Teflon研磨棒均質(zhì)細(xì)胞;將置于玻璃制陶器中的細(xì)胞懸液按30 - 40times次于置于玻璃制陶器中的細(xì)胞懸液。

CRITICAL STEP Teflon–glass偶聯(lián)代表了細(xì)胞均質(zhì)化和線粒體完整性的保存之間的最佳妥協(xié)。更嚴(yán)酷的技術(shù)，包括玻璃制陶器中的玻璃杵，很容易破壞線粒體。

在開始操作前，將玻璃器皿在冰浴中預(yù)冷5分鐘。均質(zhì)和以下步驟必須在4℃下進(jìn)行，以最大限度地減少具有破壞性的磷脂酶和蛋白酶的激活。

！ 注意在使用均質(zhì)器時，請戴上防護(hù)手套，以避免在不太可能發(fā)生的情況下造成損壞。？

(ix)將勻漿轉(zhuǎn)移到50毫升聚丙烯Falcon管中，在4 ℃下600克離心10分鐘。

(x)收集上清，轉(zhuǎn)移到玻璃離心管中，7000g, 4 ℃離心10分鐘。？

(xi)棄掉上清液，用200μl冰冷的IBc清洗顆粒。將顆粒重新懸浮在200μl冰冷的IBc中，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到1.5毫升微濾管中。

(xii)7 000g勻漿在4 ℃下離心10分鐘。

(xiii)倒出上清，重懸含線粒體的顆粒。你可以用玻璃棒來松開小球糊。避免加入IB，并嘗試在丟棄上清后殘留的少量緩沖液中重新懸浮線粒體。使用200μl 移液器，避免再懸浮過程中產(chǎn)生氣泡。

(xiv)將線粒體懸浮液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，冷藏。

避免用緩沖液稀釋線粒體。當(dāng)線粒體以濃縮的形式儲存時，它們的功能保持的時間更長，這可能是由于它們接觸氧氣的時間較低的結(jié)果。

(xv)用雙縮脲法測定線粒體濃度。

PAUSE POINT線粒體現(xiàn)在可以在實驗中使用了:在1-3小時內(nèi)使用該制劑可以獲得更好的功能反應(yīng)。

CRITICAL STEP 這種制劑的典型收率為50 mg ml-1在大約0.1 ml的總體積中

CRITICAL STEP 在從本方案獲得的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，用于測量線粒體濃度的縮二脲法是準(zhǔn)確的；可以使用其他方法，如Bradford法，但必須稀釋線粒體裂解物，以避免探針飽和。

圖4 |小鼠肝臟線粒體分離時間。

圖5 |小鼠骨骼肌線粒體分離時間。

(B)小鼠肝臟線粒體的分離時間約為1小時

(i)在分離實驗前將小鼠饑餓過夜。

(ii)通過頸脫位殺死一只成年小鼠(約30 g)，并迅速從腹膜腔切除肝臟。找到膽囊，用手術(shù)刀取出。將肝臟浸泡在50毫升冰冷的IBc中，置于小燒杯中。關(guān)于動物護(hù)理和處理的地方和國家法規(guī)各不相同。檢查你是否持有進(jìn)行動物實驗的適當(dāng)授權(quán)。

(iii)使用冰冷的IBc清洗肝臟，除去血液。通常，四五次清洗就足以使IBc完全澄清。

(iv)用剪刀將肝切成小塊。這應(yīng)該在保持燒杯在冰浴中進(jìn)行。

(v)丟棄切碎過程中使用的 IBc，代之以5毫升冰冷新鮮IBc。把懸浮液轉(zhuǎn)移到玻璃制陶器上。均質(zhì)和以下步驟必須在4℃條件下進(jìn)行，以最大限度地減少破壞性磷脂酶和蛋白酶的激活。

(vi)用Teflon搗棒以1600轉(zhuǎn)/分的速度將肝臟勻漿，輕擊切碎的肝臟3至4次。組織與分離緩沖液的最佳配比為1:5 ~ 1:10 (w:v)。在開始操作前，將玻璃器皿在冰浴中預(yù)冷5分鐘。均質(zhì)和以下步驟必須在4℃下進(jìn)行，以最大限度地減少破壞性磷脂酶和蛋白酶的激活。！ 注意在使用均質(zhì)器時，請戴上防護(hù)手套，以避免在不太可能發(fā)生的情況下造成損壞。？

 (vii)將勻漿轉(zhuǎn)移到50ml聚丙烯Falcon管中，在4 ℃下600克離心10分鐘。

(viii)將上清液轉(zhuǎn)移到玻璃離心管中，在7000g的溫度下在4 ℃下離心10分鐘。？

 (ix)棄掉上清液，用5ml冰冷的IBc清洗顆粒。

(x)在4℃下7000 g離心10分鐘。

(xi)丟棄上清，重懸含線粒體的顆粒。你可以用玻璃棒來松開小球糊。避免加入IB，并嘗試在丟棄上清后殘留的少量緩沖液中重新懸浮線粒體。使用1ml移液器，避免在再懸浮過程中形成氣泡。

(xii)將線粒體懸液轉(zhuǎn)移到14 ml Falcon試管中，冷藏。避免用緩沖液稀釋線粒體，因為在濃縮的情況下，線粒體保留功能的時間更長，最大限度地減少與氧氣的接觸。暫停點線粒體現(xiàn)在可以用于實驗;在1-3小時內(nèi)使用該制劑以獲得更好的功能反應(yīng)。

(xiii)用雙縮脲法測定線粒體濃度。

線粒體關(guān)鍵步驟通常集中在這種準(zhǔn)備是大約80毫克/毫升和總量大約是1 ml.

關(guān)鍵一步的雙縮脲法測定線粒體蛋白質(zhì)濃度范圍的準(zhǔn)確濃度從這個協(xié)議中獲得;也可以使用其他方法，如Bradford法，但必須稀釋線粒體裂解液，以避免探針飽和。

C)小鼠骨骼肌線粒體分離時間約1.5小時

(i)通過頸椎脫位殺死小鼠。使用手術(shù)刀，迅速取出感興趣的骨骼肌，并將其浸泡在一個小燒杯中，該燒杯含有5毫升冰水PBS，其中添加了10 mM EDTA。圖6列出了該協(xié)議的時間表。關(guān)于動物護(hù)理和處理的地方和國家法規(guī)各不相同。檢查您是否持有進(jìn)行動物實驗的適當(dāng)授權(quán)。用EDTA代替EGTA也能螯合Mg2+， Mg2+在肌肉組織中非常豐富(因為ATP含量很高)。Mg2+可影響線粒體功能及細(xì)胞色素c釋放動力學(xué)25。

(ii)用剪刀將肌肉切成小塊，并修剪可見的脂肪、韌帶和結(jié)締組織。

(iii)用含10 mM EDTA的冰水PBS清洗絞肉2 - 3次。(iv)將絞碎的肌肉用含10 mM EDTA和0.05%胰蛋白酶的5 ml冰水PBS重懸30分鐘。

(v) 200g離心5分鐘，棄上清。在IBm1中重新懸浮顆粒。

(vi)在IBm1中重新懸浮顆粒。

(vii) 使用每分鐘1600轉(zhuǎn)的Teflon搗棒均勻化肌肉;擊打剁碎的肌肉十次。組織與分離緩沖液的最佳配比為1:5 ~ 1:10 (w:v)。在開始操作前，將玻璃器皿在冰浴中預(yù)冷5分鐘。均質(zhì)和以下步驟必須在4℃下進(jìn)行，以最大限度地減少破壞性磷脂酶和蛋白酶的激活。！

注意在使用均質(zhì)器時，請戴上防護(hù)手套，以避免在不太可能發(fā)生的情況下造成損壞。在開始以下步驟之前，將玻璃器皿在冰浴中預(yù)冷5分鐘。？

 (viii)將勻漿轉(zhuǎn)移到50ml聚丙烯Falcon管中，在4 ℃下700g離心10分鐘。

(ix)將上清轉(zhuǎn)移到玻璃離心管中，在8000g、4 ℃下離心10分鐘。？

 (x)棄掉上清液，用5ml冰浴IBm2重新懸浮顆粒。

(xi)在4℃下8000 g離心10分鐘。

(xii)棄上清，重懸含線粒體顆粒。你可以用玻璃棒來松開小球糊。避免加入IB，并嘗試在丟棄上清后殘留的少量緩沖液中重新懸浮線粒體。使用200ml移液器，避免在再懸浮過程中產(chǎn)生氣泡。

(xiii)將線粒體懸液轉(zhuǎn)移到14 ml Falcon試管中，冷凍保存。(xiv)用雙縮脲法測定線粒體濃度。該制劑通常產(chǎn)0.8 ml 50 mg/ml -1線粒體。雙縮脲法測量線粒體濃度是準(zhǔn)確的范圍內(nèi)的蛋白濃度從本協(xié)議獲得;也可以使用其他方法，如Bradford法，但必須稀釋線粒體裂解液，以避免探針飽和。

測量線粒體呼吸時間約1 h

2|校準(zhǔn)克拉克型氧電極。程序因儀器而異。你應(yīng)該按照制造商的說明使用你所使用的儀器。

3|將裝有緩沖液的燒杯置于連接oxygraph的水浴中，平衡EBc或EBm的溫度和氧張力。在20 - 30分鐘后，緩沖液的溫度很可能與水浴的溫度達(dá)到平衡。

4|向血氧儀室中加入適量的EB。從細(xì)胞中分離出的線粒體用0.5 ml，肝臟和肌肉線粒體用1或2 ml。關(guān)閉血氧儀室。

5|開始記錄耗氧量。

確認(rèn)記錄是穩(wěn)定的，沒有明顯的漂移。漂移可能掩蓋了線粒體制備的耗氧量，從而使結(jié)果的解釋復(fù)雜化。？

 6|等待2分鐘，獲得穩(wěn)定基線。

7|使用適當(dāng)?shù)臐h密爾頓微注射器，加入線粒體，最終濃度為1mg/ml 1。由于分離出的線粒體缺氧，會觀察到艙內(nèi)氧含量的短暫快速下降;隨后是線粒體的呼吸作用引起的緩慢的減少。這是由內(nèi)源性底物支持的，通常稱為狀態(tài)1呼吸26。

8|記錄耗氧量直到停止。！ 在肝臟線粒體狀態(tài)1時，呼吸通常不會停止。

9| 使用漢密爾頓微型注射器，添加適當(dāng)濃度的呼吸底物和抑制劑復(fù)合物的呼吸鏈你想研究(參見表1)。線粒體懸液現(xiàn)在將開始消耗氧氣的呼吸鏈的基底活動抵消內(nèi)部的線粒體膜質(zhì)子泄漏。這就是所謂的 ''state 2’’呼吸狀態(tài)。現(xiàn)在耗氧速率應(yīng)該比單獨使用緩沖液觀察到的速率快。這表明你已經(jīng)獲得了有功能的、可呼吸的線粒體。

10|記錄5分鐘。

11|加入ADP，最終濃度為100 - 150μM。會觀察到更快的氧氣消耗。這是由于質(zhì)子通過ATP酶的莖部分反向擴散造成的，而ATP酶通過呼吸鏈更快地流向末端電子受體O2，得到了補償。這就是通常所說的“狀態(tài)3”呼吸。

現(xiàn)在，耗氧速率應(yīng)該比單獨使用底物時觀察到的速率快，這表明我們已經(jīng)獲得了良好耦合的線粒體。用ADP觀察到的呼吸增加因組織和底物的不同而不同。作為一般規(guī)則,以及質(zhì)量控制的唯一目的的準(zhǔn)備,最低要求來進(jìn)行這次實驗如下:使用谷氨酸酸鹽作為底物,保持2的比例從細(xì)胞系中分離的線粒體和4的比率線粒體從組織中分離出來的線粒體。

12|等待呼吸減慢，恢復(fù)到加入ADP前的速率。這是由添加ADP的消耗引起的。ADP衰竭后的呼吸通常被稱為“狀態(tài)4”呼吸26。

13|等待3分鐘。

14| 加入解耦劑FCCP，最終濃度為60-100 nM。

15|呼吸會加速，達(dá)到略高于記錄狀態(tài)3呼吸時的值。？ 故障排除

16|再記錄5分鐘，然后停止記錄。

步驟1A:大約2小時，取決于使用的細(xì)胞數(shù)量;然而，細(xì)胞需要提前2 - 3天播種才能生長

步驟1B:大約1小時;然而，老鼠需要從前一天晚上開始禁食

步驟1C: 1.5小時，這取決于切碎的肌肉量

預(yù)期結(jié)果

線粒體制劑的目標(biāo)是獲得大量相對純凈、偶聯(lián)良好的線粒體。獲得的細(xì)胞器的質(zhì)量可以用氧合照相法測定其耗氧量來檢驗。例如，從小鼠肝臟中分離出來的線粒體，在谷氨酸/蘋果酸的刺激下，通過添加6倍的ADP對atp酶產(chǎn)生反應(yīng)耗氧量的增加(圖6b)。這通常反映了高度純凈和完整的線粒體。仔細(xì)看看常規(guī)電鏡形態(tài)學(xué)和其他細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器分離膜的純度顯示大部分細(xì)胞器的顯示一個完整的內(nèi)部和外膜,由其他膜污染水平保持在最低(圖6)。

圖6 |根據(jù)所提供的方案分離的小鼠肝線粒體的超微結(jié)構(gòu)和耗氧量。(a)線粒體超微結(jié)構(gòu)。通過加入戊二醛(最終濃度2.5% (v/v))固定在補充有5 mM谷氨酸鹽和2.5 mM蘋果酸鹽的EB中孵育5分鐘的小鼠肝線粒體(0.5 mg ml/1)。透射電子顯微照片是從隨機選擇的視野中獲得的，如18所述。(b)補充5 mM谷氨酸鹽和2.5 mM蘋果酸鹽的1 ml EB的耗氧量。如所示(箭頭)，添加小鼠肝線粒體(MLM，最終濃度1 mg ml1)、ADP (100 mM)和FCCP (60 nM)。ADP刺激后的呼吸稱為“狀態(tài)3”，而消耗添加的ADP后的呼吸稱為“狀態(tài)4”。''

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