小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）是大腦的免疫細(xì)胞，是中樞神經(jīng)細(xì)胞的第一道也是最主要的一道免疫防線。穩(wěn)定調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的平衡狀態(tài)，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持非常關(guān)鍵，過多激活甚至導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞失控，會(huì)帶來神經(jīng)毒性的傷害，引發(fā)神經(jīng)退行性疾病。

小膠質(zhì)細(xì)胞平衡狀態(tài)調(diào)控的重要機(jī)制包括減少炎性損傷、促進(jìn)組織修復(fù)、代謝重編程等。

小膠質(zhì)細(xì)胞在感染、外傷、缺血缺氧性損傷等外部因素刺激下，腦內(nèi)微環(huán)境中IL-1β、LPS、TNF-α等作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，使其從靜息分支狀態(tài)向阿米巴樣激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-6等促炎因子，或者IL-10、IL-4、TGF-β、IL-13等抗炎因子。

代謝重組是指小膠質(zhì)細(xì)胞代謝方式發(fā)生變化，以氧化磷酸化減少、糖酵解增加為特征。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞具有“可塑性”，即可根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的變化，調(diào)控代謝途徑進(jìn)行代謝重組，從而改變轉(zhuǎn)錄表型和功能表型，影響疾病的進(jìn)程。

深入了解小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝重編程在神經(jīng)退行性疾病中的作用，可為開發(fā)更有效的神經(jīng)退行性疾病治療靶點(diǎn)提供新策略和新思路。

小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制

2021年度國(guó)自然醫(yī)學(xué)部國(guó)自32大科研熱點(diǎn)的中標(biāo)數(shù)統(tǒng)計(jì)如下：

今天給大家?guī)淼奈恼率莵碜蕴K州大學(xué)發(fā)表在aging cell（IF=9.304）題為“Microglial MT1activation inhibits LPS--induced neuroinflammation viaregulation of metabolic reprogramming”的文章，即小膠質(zhì)細(xì)胞 MT1 激活通過調(diào)節(jié)代謝重編程抑制 LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。

∞研究概要∞

作為最常見的神經(jīng)退行性疾病，帕金森病的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。前人的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥對(duì)帕金森發(fā)病機(jī)制呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。褪黑素受體MT1廣泛存在于黑質(zhì)（SN）的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上。作為一種神經(jīng)保護(hù)因子，很大程度也參與了帕金森的發(fā)病機(jī)制。作者在PD小鼠通過MPTP誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，SN小膠質(zhì)細(xì)胞上的MT1明顯減少。增加小膠質(zhì)細(xì)胞的MT1能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，而減少M(fèi)T1則顯著增加神經(jīng)炎癥的癥狀。小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝重編程促進(jìn)MT1的消炎作用，過量的LPS會(huì)損傷有氧糖酵解和氧化磷酸化過程，而增加MT1則可以逆轉(zhuǎn)這一過程。作者發(fā)現(xiàn)，MT1能夠正向調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶PDHA1的表達(dá)，增強(qiáng)OXPHOS。另外，MT1也能減少培養(yǎng)基對(duì)多巴胺細(xì)胞系的毒性，在模型小鼠能夠觀察到增加MT1能夠增強(qiáng)消炎作用。

分子機(jī)制圖

1、Mtr1a缺乏造成小膠質(zhì)細(xì)胞基于LPS誘導(dǎo)的促炎癥因子的聚集和上調(diào)

作者敲低了 BV2 細(xì)胞中編碼 MT1 的Mtnr1a以評(píng)估 Mtnr1a 缺乏是否可能影響 LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。發(fā)現(xiàn) LPS 促進(jìn)了 iNOS 和COX-2 的產(chǎn)生，而用 小干擾 RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞增加了產(chǎn)量而不影響 BV2 細(xì)胞活力（圖 1a）。在原代小膠質(zhì)細(xì)胞中，MT1 缺乏也明顯增強(qiáng)了 LPS 誘導(dǎo)的iNOS 和 COX-2 的表達(dá)（圖 1f）。Mtnr1a 下調(diào)后的初級(jí)小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出類似變形蟲的特征，細(xì)胞體膨脹，暗示其細(xì)胞激活（圖 1g）。LPS 明顯增加了 iNOS、COX-2、IL-6 和 TNF-α的 mRNA 水平，Mtnr1a 敲低 BV2 細(xì)胞的增加幅度更大（圖 1b-e）。這些數(shù)據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中 Mtnr1a 的缺乏加劇了對(duì) LPS 的促炎因子反應(yīng)的產(chǎn)生。

2、MT激動(dòng)劑Ramelteon抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生

用廣譜性 MT 激動(dòng)劑Ramelteon 預(yù)處理LPS 刺激的 BV2 細(xì)胞或原代小膠質(zhì)細(xì)胞，以劑量依賴性方式顯著抑制促炎蛋白（如 iNOS 和 COX-2）的增加，而不影響細(xì)胞活力（圖 1h、m）。同時(shí)，這些促炎因子的mRNA 水平以及 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 水平也被下調(diào)（圖 1i-l）。這些數(shù)據(jù)表明，MT1 激活可以抑制 LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。

圖1

3、Ramelteon的抗炎作用特別依賴于MT1

為了排除任何受體非依賴性對(duì) Ramelteon 抗炎作用的影響，作者在 Ramelteon 治療前用 MT 拮抗劑 Luzindole 處理BV2 細(xì)胞。Luzindole 以劑量依賴性方式抑制Ramelteon 的抗炎作用（圖 2a）。在 LPS 處理的 BV2 細(xì)胞中，MT2 特異性激動(dòng)劑(IIK7) 和 MT2 敲低均未對(duì) Ramelteon 誘導(dǎo)的抗炎反應(yīng)產(chǎn)生任何影響（圖 2b），用拮抗劑 (4P-PDOT) 處理的細(xì)胞也是如此（圖 2c）。相比之下，BV2 細(xì)胞中的Mtnr1a 敲低抑制了 Ramelteon 的抗炎作用（圖2d-f）。這些數(shù)據(jù)表明，MT1 激活對(duì)于抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥至關(guān)重要。

4、MT1激活的抗炎作用獨(dú)立于經(jīng)典的GPCR信號(hào)

LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化不受 SQ22536 預(yù)處理的影響，因此，MT1 激活的抗炎作用與 GPCR的Gαi 信號(hào)無關(guān)（圖 2g）。作者又測(cè)試了另一種與 MT1 相關(guān)的 G 蛋白 Gαq，發(fā)現(xiàn)在施用 Ramelteon 和 LPS 之前用PLCβ 抑制劑 U73122 預(yù)處理 BV2 細(xì)胞不影響 Ramelteon 的抗炎作用，因此，Gαq 信號(hào)不參與 MT1 激活的抗炎作用（圖 2h）。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，MT1的消炎效果與GPCR信號(hào)無關(guān)。

圖2

5、小膠質(zhì)細(xì)胞代謝重編程參與MT1活化的抗炎作用

作者使用試劑盒來測(cè)定葡萄糖和乳酸，以測(cè)量不同處理下小膠質(zhì)細(xì)胞的葡萄糖消耗和細(xì)胞外乳酸的產(chǎn)生。與之前的研究一致，LPS 促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生（圖 3a、b、e、f）。當(dāng) Mtnr1a 被敲低時(shí)，BV2 細(xì)胞（圖 3a，b）和原代小膠質(zhì)細(xì)胞（圖 3e，f）中的葡萄糖消耗和細(xì)胞外乳酸產(chǎn)生增加。相反，在用 Ramelteon 預(yù)處理的 BV2 細(xì)胞（圖 3c、d）或原代小膠質(zhì)細(xì)胞（圖 3g、h）中，葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生受到顯著抑制。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞 MT1 激活可以將其代謝狀態(tài)從有氧糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)?OXPHOS。有趣的是，用 2-DG 預(yù)處理細(xì)胞逆轉(zhuǎn)了由 Mtnr1a 敲低引起的 LPS 誘導(dǎo)的炎癥的增加（圖 3i）。這些數(shù)據(jù)意味著，代謝重編程調(diào)節(jié)確實(shí)參與了 MT1 調(diào)節(jié)的炎癥。

圖3

6、丙酮酸脫氫酶亞基PDHA1參與MT1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞代謝重編程

作者從 Mtnr1a 缺陷和正常小膠質(zhì)細(xì)胞中分離并測(cè)序總 RNA。與正常組相比，在 Mtnr1a 缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞中共有 186 個(gè)基因上調(diào)，384 個(gè)基因下調(diào)（圖 4a，b）。KEGG顯示其中許多基因與某些代謝途徑有關(guān)，包括丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)和脂肪酸代謝（圖 4a、c）。熱圖揭示了表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因，發(fā)現(xiàn) Pdha1 在 Mtnr1a 缺陷型小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)顯著降低（圖4d）。在轉(zhuǎn)錄水平，Pdha1 表達(dá)在Mtnr1a 缺陷型 BV2 細(xì)胞中顯著降低（圖 4e），而在 Ramelteon 處理（MT1 激活）細(xì)胞中顯著增加。類似地，MT1 在 BV2 細(xì)胞（圖 4g，h）和原代小膠質(zhì)細(xì)胞（圖 4i，j）中正調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平的 PDHA1 表達(dá)。Pdha1 敲低幾乎消除了 MT1 激活的抗炎作用（圖 4k-m）。

圖4

7、MT1 激活抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的 DA 神經(jīng)元死亡

有或沒有 Mtnr1a 敲低BV2 細(xì)胞，從 Ramelteon 預(yù)處理到LPS 刺激，制備了條件培養(yǎng)基 (CM)，用于培養(yǎng) DA 細(xì)胞系MES23.5（圖 5a）。MES23.5 細(xì)胞用 Hochest 和碘化丙啶 (PI) 染色（圖 5b、c），并測(cè)定cleaved-caspase3 以評(píng)估細(xì)胞凋亡（圖 5d、e）。來自LPS 刺激的 BV2 細(xì)胞的 CM 的神經(jīng)毒性明顯增加，而當(dāng)細(xì)胞與來自用 Ramelteon 預(yù)處理的 LPS 刺激的 BV2 細(xì)胞的 CM 一起培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞存活率顯著增加。此外，與對(duì)照組相比，來自 Mtnr1a 敲低 BV2 細(xì)胞的CM 增加了 MES23.5 的細(xì)胞死亡。然而，BV2 細(xì)胞中 Mtnr1a 敲低幾乎消除了 Ramalteon CM 的這種保護(hù)作用（圖 5b-e）。這些數(shù)據(jù)表明，MT1激活減弱了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的 DA神經(jīng)元死亡。

圖5

8、Ramelteon在 LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥小鼠模型中抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的 DA 神經(jīng)元丟失

通過將 LPS 立體定向注射到小鼠的 SN 中來構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型。MT1 在小鼠 SN 的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)（圖 6a）。在 LPS 注射之前和之后腹膜內(nèi)注射 Ramelteon（圖 6b），隨后通過免疫組織化學(xué)進(jìn)行分析。LPS 處理顯著增加了 SN中 Iba1（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）和GFAP（膠質(zhì)酸性纖維蛋白；星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）的水平。然而，在 Ramelteon 處理組中，LPS 誘導(dǎo)的 Iba1 和 GFAP 的表達(dá)在 SN 中顯著降低（圖 6c）。此外，LPS誘導(dǎo)的酪氨酸羥化酶 (TH ) 神經(jīng)元丟失也顯著減弱（圖 6d）。Ramelteon 預(yù)處理可以顯著逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的 Iba1 增加和小鼠中腦中 TH 表達(dá)的減少（圖 6e）。

9、Ramelteon 在 MPTP 誘導(dǎo)的 PD 小鼠模型中抑制DA 神經(jīng)元丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞激活

在小鼠 SN 中，MPTP 損傷誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞MT1 減少（圖 6f）。Ramelteon 治療減輕了 MPTP 誘導(dǎo)的 TH 神經(jīng)元丟失（圖 6g）和 SN 中 TH 表達(dá)的減少（圖 6h）。Iba1 和 GFAP 的豐度在 MPTP 處理組的 SN 中增加，而Ramelteon 抑制了這種增加（圖 6i）。因此，MT 激動(dòng)劑 Ramelteon 在MPTP 誘導(dǎo)的 PD 小鼠模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用。

圖6

學(xué)術(shù)查

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