組織結(jié)構(gòu)和功能損傷修復(fù)是一個基本的生物學(xué)過程，是生命體生存所必需的。損傷修復(fù)分為兩個階段，促炎階段（抗菌防御）和促修復(fù)階段（組織生長和分化）。在這個過程中，參與損傷修復(fù)的MΦ（wound MΦ, 傷口MΦ）需要應(yīng)對損傷組織的微環(huán)境并迅速調(diào)整狀態(tài)來行使其功能。具體來說，損傷發(fā)生后，外周血單核細(xì)胞被招募到損傷部位，激活為1型MΦ，1型MΦ具有促炎和促血管生成特征，參與微生物抵御、促進(jìn)組織血管化和受損組織的再生生長。在第二階段，MΦ激活為2型，促進(jìn)瘢痕形成和修復(fù)。然而，傷口MΦ從促炎1型到促修復(fù)2型轉(zhuǎn)變的分子調(diào)控機制仍不清楚。

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（MΦ）是參與機體損傷修復(fù)的重要免疫細(xì)胞。一些研究（主要是體外研究）表明，在MΦ激活過程中伴隨著細(xì)胞代謝重編程。理解這個重編程過程會為促進(jìn)組織的修復(fù)、再生能力提供理論基礎(chǔ)。然而，在組織損傷修復(fù)過程中不同階段的MΦ的代謝重編程、信號調(diào)控、活化類型之間的關(guān)系仍不明確。

最新研究

2021年8月28日，來自科隆大學(xué)的Sabine A. Eming團隊在Cell Metabolism上發(fā)表了題為《Mitochondrial metabolism coordinates stage-specific repair processes in macrophages during wound healing》的文章，作者發(fā)現(xiàn)早期和晚期傷口MΦ在轉(zhuǎn)錄和代謝方面存在顯著差異，早期MΦ不僅需要糖酵解功能，還依賴線粒體產(chǎn)生的活性氧的來穩(wěn)定HIF-1α促進(jìn)促炎癥、促血管生長；晚期MΦ依賴于M2型信號-IL-4Ra受體-氧化磷酸化途徑增強修復(fù)功能。該發(fā)現(xiàn)揭示了愈傷過程中巨噬細(xì)胞代謝重編程的機制與意義，提供了促進(jìn)傷口MΦ功能的新靶點。

傷口MΦ在損傷早期和晚期呈現(xiàn)不同的代謝模式和基因表達(dá)模式

為了研究傷口MΦ（CD45+CD11b+F4/80+細(xì)胞）在整個損傷修復(fù)期間的代謝特征，作者使用了C57BL/6野生型小鼠背部全層切除皮膚損傷模型，從炎癥早期（損傷后4天）和瘢痕形成晚期（損傷后14天）的創(chuàng)面組織中分離出MΦ。作者首先測定了細(xì)胞耗氧率（OCR）和基礎(chǔ)細(xì)胞外酸化率（ECAR），發(fā)現(xiàn)與早期傷口MΦ相比，晚期傷口MΦ有更高的基礎(chǔ)呼吸、ATP周轉(zhuǎn)率和剩余呼吸能力，并且糖酵解程度明顯較低。Mito-TrackerTM Green （MTG）熒光染色顯示，晚期MΦ中有更多的線粒體，這與其較高的OCR一致。綜上所述，早期和晚期的傷口MΦ能量代謝特征有顯著差異，晚期MΦ較高的氧氣消耗可能是由于線粒體重量增加和OXPHOS上調(diào)引起的。

那么代謝模式重編程是由轉(zhuǎn)錄組的重編程引起的嗎？RNA-seq結(jié)果提示愈傷早期和晚期MΦ的基因表達(dá)譜有顯著的差異，在早期MΦ中促炎相關(guān)基因（Nos2和Ptgs2）和促血管生成（Vegfa）基因高表達(dá)，在晚期MΦ中2型細(xì)胞因子相關(guān)基因 （Ccl22、Ear2 Irf4, Mgll, Mgl2, Mrc1和Retnla）高表達(dá)。

通路富集的結(jié)果與兩種MΦ代謝模式也是一致的：早期MΦ表現(xiàn)出糖酵解/糖異生和HIF-1信號相關(guān)基因和通路的富集，和線粒體相關(guān)的代謝過程有血紅素代謝、檸檬酸代謝和琥珀酸代謝；而晚期MΦ在2型細(xì)胞因子誘導(dǎo)的途徑中富集，表現(xiàn)出更高的脂肪攝取和分解代謝，和線粒體相關(guān)的代謝過程有肉堿代謝、線粒體蛋白質(zhì)翻譯的tRNA氨基?；?、ATP運輸和線粒體DNA復(fù)制。上述結(jié)果表明傷口MΦ在早期和晚期有不同的基因表達(dá)模式和代謝模式。

傷口MΦ的亞群異質(zhì)性

為了進(jìn)一步解析不同時期傷口MΦ中基因表達(dá)和代謝模式的異質(zhì)性，作者對早期和晚期傷口MΦ進(jìn)行了單細(xì)胞測序（scRNA-seq）分析。結(jié)果顯示MΦ可以分為7個群。早期MΦ以2群和3群為主，而晚期MΦ以0群、1群和6群為主，這提示MΦ的細(xì)胞類型在傷口愈合的不同時期存在異質(zhì)性。對各個群中早期、晚期傷口MΦ做特征評分發(fā)現(xiàn)，同一個群中早期MΦ細(xì)胞的M1和糖酵解特征評分更高，晚期MΦ細(xì)胞的M2和OXPHOS特征評分更高，這與RNA-seq的結(jié)果是一致的，表明傷口愈合過程中MΦ從M1/糖酵解型向M2氧化型MΦ轉(zhuǎn)變。

損傷早期，線粒體呼吸鏈調(diào)控MΦ的促炎、促血管生成功能

線粒體呼吸鏈（MRC）在調(diào)控MΦ極化的代謝重編程中發(fā)揮重要作用。那么，在傷口愈合過程中MRC如何調(diào)節(jié)傷口MΦ的極化呢？

有研究報道，Dars2基因編碼線粒體天冬氨酸-tRNA合成酶2，是調(diào)控線粒體內(nèi)的呼吸鏈相關(guān)蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵基因。作者通過條件性敲除Dars2構(gòu)建了髓系細(xì)胞MRC失活的小鼠模型。作者用LPS+IFN-g處理骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDM ）[M(LPS + IFN-g)]，發(fā)現(xiàn)LPS+IFN-g顯著誘導(dǎo)了WT BMDM中促炎因子基因（Il1b, Il6和Tnfa）的表達(dá)，而在Dars2 KO 的BMDM中促炎因子變化不顯著。此外，Retnla、Arg1和Chil3在用IL-4 + IL-13處理BMDM [M(IL-4 + IL-13)]誘導(dǎo)的WT BMDM中顯著升高、在Dars2 KO BMDM中變化不顯著。這些發(fā)現(xiàn)表明在體外Dars2調(diào)控BMDM的促炎、促修復(fù)表型極化。

那么，MRC失活會影響傷口MΦ的體內(nèi)修復(fù)功能嗎？作者發(fā)現(xiàn)，與WT 小鼠相比，Dars2 MKO 小鼠的MΦ中NDUFB8 （CI）的蛋白水平顯著減少、UQCRC2 （CIII）和COX1 （CIV）的蛋白水平有一定程度的減少，這表明Dars2 KO MΦ確實發(fā)生了MRC缺陷。接下來，作者分析了Dars2 MKO小鼠的傷口愈合和組織恢復(fù)能力是否受到了影響。組織形態(tài)學(xué)分析顯示，與對照組小鼠相比，Dars2 MKO小鼠的傷口閉合顯著延遲，存在肉芽組織顯著減少、結(jié)痂脫落延遲和早期創(chuàng)面血管化顯著減少等特征，表明MRC失活會削弱傷口MΦ的體內(nèi)修復(fù)功能。有趣的是，Dars2 MKO小鼠在第4天和14天時創(chuàng)面MΦ數(shù)量和WT小鼠相當(dāng)。這表明MRC缺陷并未影響血液單核細(xì)胞招募到損傷部位。

那么MRC影響傷口MΦ功能的機制是什么？髓系細(xì)胞中HIF-1α介導(dǎo)表達(dá)的VEGFA是組織修復(fù)中促血管生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，前期RNA-seq結(jié)果提示VEGFA在早期MΦ中高表達(dá)。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)早期Dars2 MKO小鼠的MΦ中HIF-1α靶基因水平表達(dá)顯著降低（包括Vegfa、糖酵解和促炎基因），提示HIF-1α通路可能參與了MRC對MΦ功能的調(diào)控。

早期MΦ通過MRC產(chǎn)生ROS來穩(wěn)定HIF-1α以促進(jìn)血管生成

先前有研究發(fā)現(xiàn)，用LPS處理BMDM時，線粒體膜電位（MMP）增加，MRC的功能從產(chǎn)生ATP轉(zhuǎn)向琥珀酸氧化，兩者提供了反向電子傳遞的驅(qū)動力，琥珀酸氧化導(dǎo)致ROS產(chǎn)生從而促進(jìn)HIF-1α的穩(wěn)定和Il1b的表達(dá)。

作者首先利用四甲基羅丹明甲酯（TMRM）染色和流式檢測分析了WT和Dars2 MKO 小鼠的BMDM的MMP，發(fā)現(xiàn)空白處理時，WT和Dars2 KO BMDM的MMP相似，但是LPS刺激時，WT和Dars2 MKO MΦ中MMP增加程度也相當(dāng)，表明Dars2 MKO 不影響B(tài)MDM MMP變化。

接下來，作者用MitoSOX染色評估細(xì)胞mtROS的產(chǎn)生，LPS刺激后，WT BMDM 中MitoSOX+細(xì)胞比例比空白對照增加了約2.6倍，而Dars2 KO BMDM中MitoSOX+細(xì)胞比例顯著低于WT BMDM。檢測過氧化物清除基因發(fā)現(xiàn)，在體外Dars2 KO BMDM（LPS+IFN-g）中和體內(nèi)Dars2 MKO小鼠早期傷口MΦ中，Gclc、Gclm、Gsr和Sod2的表達(dá)顯著降低。這表明，Dars2敲除不影響B(tài)MDM中線粒體MMP但是顯著降低了線粒體產(chǎn)生mtROS的能力。

那么mtROS產(chǎn)生能力的降低是MRC損傷引起的嗎？對HIF-1α又有什么影響？非變性凝膠電泳顯示，與WT BMDM相比，Dars2缺陷BMDM中CI、CIII和CIV嚴(yán)重受損，在LPS+琥珀酸處理時HIF-1α依然發(fā)生降解。這表明，Dars2 KO MΦ中的MRC功能受損導(dǎo)致mtROS產(chǎn)生能力降低，進(jìn)一步導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致早期傷口MΦ促炎癥和促血管生成功能的減弱，進(jìn)而影響早期的損傷修復(fù)。

早期MΦ產(chǎn)生mtROS的細(xì)胞亞群

作者進(jìn)一步分析了scRNA-seq數(shù)據(jù)中每個亞群的血管生成特征評分，發(fā)現(xiàn)MΦ的血管生成評分在4 天和14 天時顯著增加；對單個亞群分析發(fā)現(xiàn)，不同亞群的血管生成評分存在異質(zhì)性，第3亞群的血管生成評分最高。有趣的是，血管生成評分與OXPHOS評分呈負(fù)相關(guān)，這表明愈傷相關(guān)的MΦ血管生成并不依賴于OXPHOS。

接下來，作者分析了每個亞群中與mtROS產(chǎn)生、炎癥和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)情況。在4天時，Il1b、Vegfa、Hif1a、Ldha和Slc2a1基因以及ROS清除基因Gclc、Gclm、Gsr、Sod2和Nfe2l2主要富集在0、2、3和5亞群中。值得注意的是，第3個亞群中Idh1下調(diào)、而Acod1上調(diào)，這是M1樣MΦ的特征并且反映了第3個亞群中TCA循環(huán)的下調(diào)。綜上所述，第3個亞群可能是愈傷早期MΦ重編程線粒體代謝產(chǎn)生mtROS的細(xì)胞類型。

IL-4Ra誘導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生和OXPHOS在2型MΦ活化中起重要作用

那么在創(chuàng)傷修復(fù)晚期MRC有怎樣的功能呢？作者發(fā)現(xiàn)，Dars2 MKO小鼠的晚期MΦ中MRC蛋白水平與早期MΦ沒有差異，但是晚期MΦ卻確實呈現(xiàn) 2型功能。與此同時，體外IL-4誘導(dǎo)M2型極化實驗中，Dars2缺陷BMDM的M2極化受損。這些結(jié)果提示，在體內(nèi)，損傷修復(fù)后期Dars2 KO MΦ中可能存在MRC的代償機制。

作者進(jìn)一步利用IL4在體誘導(dǎo)M2極化動物模型探索MRC功能及代償機制。IL-4c可誘導(dǎo)局部MΦ增殖和M2型激活，作者通過小鼠腹腔注射IL-4c刺激構(gòu)建2型免疫刺激模型，發(fā)現(xiàn)WT小鼠中IL-4c處理導(dǎo)致MΦ數(shù)量增加，而Dars2 MKO小鼠MΦ數(shù)量增加弱于WT小鼠。流式分選腹膜MΦ做免疫印跡分析顯示，生理鹽水處理的Dars 2 MKO小鼠的NDUFB8、UQCRC2、COX1蛋白水平比WT小鼠低，而IL-4c處理的Dars 2 MKO小鼠的OXPHOS亞基的蛋白水平比生理鹽水處理組顯著升高，并且IL-4c處理的WT小鼠和Dars2 MKO小鼠有相似的Retnla、Arg1和Chil3表達(dá)。這些結(jié)果表明，在Dars2 MKO小鼠的MΦ中M2型信號可能是通過IL-4-OXPHOS途徑激活了線粒體代償功能。

為了證實在晚期傷口MΦ中OXPHOS受到IL-4信號調(diào)控，作者首先分析了IL-4+IL-13刺激的WT BMDM線粒體的量，與對照組相比，IL-4+IL-13刺激的BMDM中線粒體顯著增加，這表明M2型信號誘導(dǎo)了線粒體生物發(fā)生。

接下來，作者使用MTG染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析了髓系細(xì)胞IL-4ra缺陷的小鼠（IL4ra MKO）和WT小鼠損傷后14天時的MΦ，與WT相比，IL4ra MKO小鼠MΦ中線粒體顯著降低，這表明晚期傷口MΦ的線粒體生物發(fā)生依賴于IL-4Ra信號。那么，IL-4ra KO對晚期損傷口MΦ線粒體呼吸作用有何影響呢？OCR顯示，與WT相比IL-4ra MKO小鼠晚期傷口MΦ的基礎(chǔ)呼吸、ATP周轉(zhuǎn)和剩余呼吸能力顯著降低；ECAR顯示，從IL-4ra MKO小鼠的晚期傷口MΦ糖酵解率顯著降低。這表明，在晚期傷口MΦ中IL-4Ra介導(dǎo)了M2型信號誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生和OXPHOS。

M2型信號通過抑制mitoISR參與Dars2 KO中 MRC功能損傷的代償

前期有研究發(fā)現(xiàn)，在非免疫細(xì)胞中，Dars2 KO引起的MRC功能損傷會誘導(dǎo)代償性應(yīng)激反應(yīng)，特別是線粒體綜合應(yīng)激反應(yīng)（mitoISR），mitoISR的特征是ATF4介導(dǎo)的單碳和葉酸途徑、絲氨酸和脯氨酸分解代謝上調(diào)。那么，Dars2 KO 的BMDM是否發(fā)生了mitoISR？

mitoISR參與M2型信號保護線粒體功能的代償機制嗎？作者發(fā)現(xiàn)，與WT相比，Dars2 KO BMDM的全細(xì)胞裂解液中MRC亞基NDUFB8、UQCRC2和COX1的蛋白水平較低。值得注意的是，雖然IL-4 + IL-13刺激對WT細(xì)胞中的MRC蛋白水平?jīng)]有顯著影響，但是Dars2 KO MΦ中IL-4 + IL-13刺激增強了MRC亞基NDUFB8、UQCRC2、COX1和ATP5A 的穩(wěn)定性。這提示M2型信號增強了MRC亞基的穩(wěn)定性。RNA-seq分析顯示，與WT相比，Dars2 KO MΦ中驅(qū)動mitoISR的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Atf4和Ddit3/Cho及其下游靶基因表達(dá)上調(diào)。IL-4+IL-13刺激消除了Ddit3/Chop的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，M2型信號可以減輕Dars2 KO對線粒體功能的負(fù)面影響。

鑒于Dars2 KO上調(diào)Ddit3/Chop的表達(dá)以及IL-4+IL-13下調(diào)Ddit3/Chop的表達(dá)，作者推測在傷口愈合的后期M2型信號可能減弱了mitoISR。qRT-PCR顯示，在WT和Dars2 KO小鼠的損傷后14天的傷口MΦ中，mitoISR特征性轉(zhuǎn)錄因子Atf4和Ddit3/Chop表達(dá)水平相當(dāng)。這表明，愈傷后期M2型信號通過抑制mitoISR保護線粒體。

總 結(jié)

傷口愈合是一個高度協(xié)調(diào)的過程，單核/巨噬細(xì)胞是該過程的重要參與者，在促炎階段參與抗菌，在促修復(fù)階段參與組織重構(gòu)。免疫細(xì)胞的功能變化常常伴隨著代謝重編程，然而巨噬細(xì)胞在愈傷過程中的代謝重編程機制一直有待闡明。本文發(fā)現(xiàn)早期傷口MΦ具有M1/糖酵解特征，晚期傷口MΦ有M2/OXPHOS特征。早期傷口MΦ中，細(xì)胞通過糖酵解和MRC產(chǎn)生mtROS穩(wěn)定HIF-1α，促進(jìn)促炎和促血管生成基因的表達(dá)；晚期傷口MΦ中，細(xì)胞受M2型信號通過IL-4ra-OXPHOS途徑進(jìn)行代謝重編程，促進(jìn)MΦ修復(fù)功能。該發(fā)現(xiàn)揭示了愈傷過程中的巨噬細(xì)胞代謝重編的調(diào)節(jié)機制，提供了增強傷口MΦ的新靶點。

文/阿司匹林 SHMM

責(zé)編/Jane

原文鏈接：

https:///10.1016/j.cmet.2021.10.004