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如果你需要大海里特定品種的魚，你會選擇用漁網(wǎng)直接捕撈， 還是選擇投放特制魚餌，吸引目標魚上鉤？ 相信睿智的你，肯定會選擇后者！ 靶向測序的核心，即靶向富集目標序列。 下面小燃帶你去看看如何在大海中靶向捕“魚”。 01 靶向測序方法介紹 目標區(qū)域測序，又稱靶向測序，是指目標序列富集后測序的研究策略。它可根據(jù)不同的應用，利用較低的數(shù)據(jù)量得到理想的靈敏度和準確度。相較全基因組與全外顯子測序，靶向測序能夠聚焦目標區(qū)域，去除冗余數(shù)據(jù)干擾，測序成本低且測序深度深，能高效經(jīng)濟發(fā)揮NGS技術的優(yōu)勢，并廣泛應用到臨床檢測、疾病篩查等眾多領域。 現(xiàn)在常用的靶向測序方法主要有三類[1]： I. 雜交捕獲法（Hybrid capture） II. 分子倒置探針富集法（Molecular inversion probes，MIP) III. PCR富集法 我們從原理入手，先來認識下這三種靶向測序方法。  雜交捕獲法 雜交捕獲法包括固相和液相雜交捕獲法兩類。固相雜交捕獲法是先選定目標DNA區(qū)域，在芯片上修飾與目標區(qū)域互補的探針；隨后在芯片上進行DNA與探針的雜交反應；最后將與探針雜交的DNA洗脫下來用于后續(xù)的測序工作（圖1左）。目前市面上的代表產品是Roche NimbleGen，特點是使用超高密度、疊瓦式排布的DNA探針，具有高富集均一度等。 液相雜交捕獲法是目前被廣泛應用的靶向測序方法，根據(jù)堿基互補原理定制帶有生物素的探針，在液相中與目的序列雜交，通過鏈酶親和素修飾的磁珠吸附帶有生物素的探針，富集目的DNA片段（圖1右）。 圖1.雜交捕獲方法（固相+液相）[1] 分子倒置探針富集法 分子倒置探針富集法即通過設計口袋型的探針，此探針兩端(紅色序列Target complementary region）能與目的區(qū)域退火，然后利用DNA聚合酶及連接酶補平缺口成完整的環(huán)狀探針，通過外切酶將游離的探針消化。完整的探針與目標區(qū)段的序列，利用通用序列作為后續(xù)文庫構建的引物[黑色序列，即PCR Primer, Probe-release clevage site；綠色序列用于Hybridization based detection；藍色序列Tag-release clevage site]，后續(xù)添加帶有生物素標記的核苷酸（黃色序列）與其過夜雜交，產物可直接作為二代測序文庫。但此法由于捕獲均一性差探針成本高，目前鮮有使用。 圖2.分子倒置探針富集法[1] PCR富集法 多重擴增PCR，又稱擴增子建庫技術。 該技術首先利用多重引物PCR反應，同時擴增多個目標區(qū)域序列，得到的擴增子產物通過PCR或酶連接反應，將二代測序接頭序列（adapter）引入，得到擴增子文庫，進行靶向測序[2]。 圖3. 基于PCR的富集法[8] 02 靶向測序策略選擇 從富集基因數(shù)及樣本數(shù)比較不同方法學的適用性及可行性，代入樣本量及單個樣本所需檢測基因數(shù)可獲得合適的檢測方法，但選擇合適的測序方法還需考慮更多因素（圖4）。 表1則分別從成本，適用性、樣本量、靈敏度、特異性、一致性及重復性各方面作比較。 表1.靶向測序方法介紹[1] 靶向測序策略各方法學性能對比簡單歸納如下： PCR富集法：靈敏度高，檢測速度快；但其檢測區(qū)域小，一般適用于少量基因或者熱點突變的檢測；另外同時使用多對引物可能產生非特異性擴增和二聚體，且擴增的GC偏好導致覆蓋均一度差（影響CNV），是PCR富集法相比雜交捕獲法的一大劣勢。 MIP富集法：無需剪切基因組DNA即可捕獲目的序列，探針含測序引物等，因此樣本質量要求低且建庫時長短。但面對目的長序列及高GC含量區(qū)，MIP探針設計困難且均一度差，捕獲效率低，目前鮮有使用。 雜交捕獲法：探針設計為重中之重，捕獲效率均一性表現(xiàn)優(yōu)異。雜交捕獲方法能夠在單個實驗中比PCR更快，更方便地捕獲大目標區(qū)域。 其中固相雜交相比多重PCR，其對大區(qū)域的富集有明顯優(yōu)勢，且固相雜交代表產品NimbleGen SeqCap的超高密度疊瓦式探針排布策略靈敏度高，所需的測序深度更低，但需要微陣列玻片及昂貴的硬件。液相雜交無需專門設備即可進行溶液內靶標富集，比固相雜交更易于擴展，靈敏度和特異性也表現(xiàn)優(yōu)異。 下面重點介紹應用最為廣泛的液相雜交捕獲法，各性能主要取決于探針種類、設計等，具體區(qū)別如下： ■ 核酸探針比較 核酸探針類型分為RNA和DNA[3]兩類，DNA探針又分為ssDNA和dsDNA[4]，具體特點[5][6][7]如下： 表2. 核酸探針類型比較 此外，基于不同類型探針的特異性限定（即雜交的錯配容忍度）及合成成本等因素，匯總目前市面上不同品牌探針分類如下[4][5][8][9][10]：
表3.不同品牌探針分類及長度對比 ■ 探針覆蓋策略比較 比較固相雜交（NimbleGen SeqCap）、液相雜交（Agilent SureSelect）、MIP （Agilent Haloplex）和PCR（illumina Nextera）的覆蓋策略（圖5）各方法的不同參數(shù)結果。
圖5.不同方法對目標區(qū)域的覆蓋策略[11] 可見MIP選擇覆蓋目標區(qū)域兩側，其他探針都是直接覆蓋目標區(qū)域。SeqCap探針密度更高、疊瓦式設計，Agilent采用RNA探針等策略[13]。不同探針長度、設計方式及探針之間的覆蓋程度策略，直接影響文庫復雜度，均一性等測序結果。 ■ 探針設計參數(shù) 密度與交錯程度Density: End to end是常規(guī)探針設計方式，密度表示目標區(qū)域中每個核苷酸所需探針數(shù)。 Overlap tilling是設計疊瓦式探針。 重復序列的捕獲程度Masking： 高拷貝重復區(qū)，設計時降低探針密度，減少非特異序列的結合。 高GC區(qū)探針彌補Boosting： 高通量測序過程當中，高GC區(qū)段被測到的概率會比較低。因此需要針對高GC區(qū)域多設計探針彌補GC Bias[14]。 此外，不同雜交捕獲探針設計時參考數(shù)據(jù)庫以及可捕獲范圍也會有所區(qū)別[15]。 03 小結 所謂合適的才是最好的，實驗室選擇靶向測序方法及產品時應充分考慮[12]： I. 實驗室條件及設計方案的比較： 如商品化試劑盒是否滿足需求，起始樣本在質量和數(shù)量上有無要求，成本等； II. 性能因素： 實驗的簡便性及可擴展性，時間成本，是否能自動化和所需要專用硬件的要求等； III.富集和測序效果的比較： 突變類型，中靶率，覆蓋均一性及靈敏度等。 如果文章對您有所幫助，歡迎點贊和分享 贊與不贊，小燃都在這里，我們下期再見！ 參考資料： [1]Mamanova, L., Coffey, A., Scott, C. et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat Methods 7, 111–118 (2010). [2]https://www./techniques/sequencing.html [3]Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 27, 182–189 (2009). [4]https://www. [5]https://www. [6]Marcy, Joshua. 'RNA Methods: A Lab Guide.(RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization)(Brief Article)(Book Review).' Genomics & Proteomics June(2005). [7]Janine, Meienberg , et al. New insights into the performance of human whole-exome capture platforms. Nuclc Acids Research 43.11(2015):e76-e76. [8]https://www. [9]https://www. [10]https://sg./pages [11]Samorodnitsky, Eric, Datta, Jharna, Jewell, Benjamin M. et al. Comparison of Custom Capture for Targeted Next-Generation DNA Sequencing.Journal of Molecular Diagnostics Jmd (2015). [12]Kozarewa, Iwanka , et al. Overview of Target Enrichment Strategies.Current Protocols in Molecular Biology 112(2015):7.21.1. [13]https://earray.chem./suredesign/help/Create_a_SureSelect_design_with_the_wizard.htm [14]https://www./zh-cn/video/custom-sureselect-design [15]Clark, M., Chen, R., Lam, H. et al. Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. Nat Biotechnol 29, 908–914 (2011).  關于燃石醫(yī)學 燃石醫(yī)學（納斯達克代碼：BNR）成立于2014年，公司使命為“用科學守護生命之光”，專注于為腫瘤精準醫(yī)療提供具有臨床價值的二代基因測序（NGS）。公司業(yè)務及研發(fā)方向主要覆蓋：1）基于NGS的腫瘤患病人群檢測，6年間，燃石累計檢測樣本超過18.5萬例，在中國擁有最高的市場份額；2）基于NGS的癌癥早檢，目前已經(jīng)進入臨床驗證階段。燃石醫(yī)學于2018年7月獲國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）頒發(fā)的中國腫瘤NGS檢測試劑盒第一證，在體外診斷領域具有里程碑式意義。實驗室獲得廣東省臨檢中心頒發(fā)的“高通量測序實驗室”技術審核，以及得美國CLIA和CAP實驗室質量體系資質認證。公司將繼續(xù)致力于開發(fā)創(chuàng)新可靠的NGS檢測產品，推動腫瘤精準醫(yī)療領域的發(fā)展。 |
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來自： 劉得光3p6n6zqq > 《燃石醫(yī)學》
