技術(shù)領(lǐng)域

[0001]本發(fā)明涉及分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

[0002]乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，50萬(wàn)婦女因乳腺癌死亡。北美和歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，雖然亞洲是乳腺癌的低發(fā)區(qū)，但乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，且有年輕化趨向。同時(shí)，中國(guó)的乳腺癌發(fā)病的增長(zhǎng)率卻是全球第一。然而，癌癥的診斷和治療仍主要依靠經(jīng)典的組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，需要一種更量化的診斷方法和合理的個(gè)體化治療。由于僅使用他莫西芬治療的患者術(shù)后10年遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的可能性約為15％，如果將其提供給所有人，至少85％的患者會(huì)過(guò)度使用化療。因此需要一種更為準(zhǔn)確的方法能夠快速的檢測(cè)并評(píng)估患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)輔助臨床治療、提高用藥的有效率，降低患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

[0003]21基因檢測(cè)不僅能提供1-5年及5年后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，還能預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性浸潤(rùn)性乳腺癌患者的對(duì)化療和內(nèi)分泌治療的獲益程度。乳腺癌21基因檢測(cè)于2005年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，是唯一獲得美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)和美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)聯(lián)合推薦的多基因檢測(cè)項(xiàng)目。

[0004]乳腺癌21基因檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)21個(gè)基因，觀察它們之間的相互作用來(lái)判斷腫瘤特性，從而可預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)指數(shù)以及接受化療的效益比。由16個(gè)癌癥相關(guān)基因和5個(gè)內(nèi)參基因組成。16個(gè)癌癥相關(guān)基因分成五組，細(xì)胞增殖相關(guān)的基因：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2；細(xì)胞侵襲相關(guān)基因：MMP11、CTSL2；雌激素相關(guān)基因：ER、PGR、BCL2、SCUBE2；HER2相關(guān)基因：GRB7和ERBB2；三個(gè)獨(dú)立的基因：GSTM1、CD68、BAG1。5個(gè)內(nèi)參基因：ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC。上述基因的選擇是根據(jù)癌癥相關(guān)文獻(xiàn)、微陣列數(shù)據(jù)資料、基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分子生物學(xué)資料選定250個(gè)基因作為候選基因。根據(jù)3個(gè)獨(dú)立的臨床試驗(yàn)共447例患者的研究結(jié)果，選取與遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)顯著相關(guān)的基因，對(duì)250個(gè)候選基因進(jìn)一步篩選，最終確定了上述16個(gè)癌癥相關(guān)基因，并確定了5個(gè)管家基因作為參考基因。乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)現(xiàn)行的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為復(fù)發(fā)評(píng)分RS<18，為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，化療獲益小，可考慮只進(jìn)行內(nèi)分泌治療；RS位于18<rs31，為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，輔助化療獲益較大。

[0005]現(xiàn)有乳腺癌21基因檢測(cè)方法均使用兩步法逆轉(zhuǎn)錄PCR，步驟繁瑣，且容易造成cDNA污染，另外，檢測(cè)管數(shù)常使用21個(gè)，大大增加了成本和操作復(fù)雜度；市場(chǎng)需要一種操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)通量高的乳腺癌21基因檢測(cè)方法，本發(fā)明解決這樣的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明優(yōu)化了多重逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)體系，使得21個(gè)基因可以在6管反應(yīng)中得到準(zhǔn)確檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)通量，節(jié)省了成本，降低了實(shí)驗(yàn)操作的難度；再配合一步法逆轉(zhuǎn)錄體系，直接使用RNA作為檢測(cè)模板，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，避免了潛在的污染。

[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

[0008]一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒，包括：6管反應(yīng)體系，每管檢測(cè)3-4種基因，標(biāo)記3-4種熒光基團(tuán)；

[0009]乳腺癌21基因包括：STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1、Ki67(MKI67)、MYBL2、HER2(ERBB2)、GRB7、BCL2、ER、PGR、SCUBE2、MMP11、CTSL2、GSTM1、CD68、BAG1、ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；

[0010]針對(duì)AURKA基因的引物包括：名稱為F1，序列為SEQ ID NO.01，名稱為R1，序列為SEQ ID NO.02；探針包括：名稱為P1，序列為SEQ ID NO.43；

[0011]針對(duì)BIRC5基因的引物包括：名稱為F2，序列為SEQ ID NO.03，名稱為R2，序列為SEQ ID NO.04，探針包括：名稱為P2，序列為SEQ ID NO.44；

[0012]針對(duì)CCNB1基因的引物包括：名稱為F3，序列為SEQ ID NO.05，名稱為R3，序列為SEQ ID NO.06，探針包括：名稱為P3，序列為SEQ ID NO.45；

[0013]針對(duì)Ki67基因的引物包括：名稱為F4，序列為SEQ ID NO.07，名稱為R4，序列為SEQ ID NO.08，探針包括：名稱為P4，序列為SEQ ID NO.46；

[0014]針對(duì)MYBL2基因的引物包括：名稱為F5，序列為SEQ ID NO.09，名稱為R5，序列為SEQ ID NO.10，探針包括：名稱為P5，序列為SEQ ID NO.47；

[0015]針對(duì)ERBB2基因的引物包括：名稱為F6，序列為SEQ ID NO.11，名稱為R6，序列為SEQ ID NO.12，探針包括：名稱為P6，序列為SEQ ID NO.48；

[0016]針對(duì)GRB7基因的引物包括：名稱為F7，序列為SEQ ID NO.13，名稱為R7，序列為SEQ ID NO.14，探針包括：名稱為P7，序列為SEQ ID NO.49；

[0017]針對(duì)BCL2基因的引物包括：名稱為F8，序列為SEQ ID NO.15，名稱為R8，序列為SEQ ID NO.16，探針包括：名稱為P8，序列為SEQ ID NO.50；

[0018]針對(duì)ER基因的引物包括：名稱為F9，序列為SEQ ID NO.17，名稱為R9，序列為SEQ ID NO.18，探針包括：名稱為P9，序列為SEQ ID NO.51；

[0019]針對(duì)PGR基因的引物包括：名稱為F10，序列為SEQ ID NO.19，名稱為R10，序列為SEQ ID NO.20，探針包括：名稱為P10，序列為SEQ ID NO.52；

[0020]針對(duì)SCUBE2基因的引物包括：名稱為F11，序列為SEQ ID NO.21，名稱為R11，序列為SEQ ID NO.22，探針包括：名稱為P11，序列為SEQ ID NO.53；

[0021]針對(duì)CTSL2基因的引物包括：名稱為F12，序列為SEQ ID NO.23，名稱為R12，序列為SEQ ID NO.24，探針包括：名稱為P12，序列為SEQ ID NO.54；

[0022]針對(duì)MMP11基因的引物包括：名稱為F13，序列為SEQ ID NO.25，名稱為R13，序列為SEQ ID NO.26，探針包括：名稱為P13，序列為SEQ ID NO.55；

[0023]針對(duì)BAG1基因的引物包括：名稱為F14，序列為SEQ ID NO.27，名稱為R14，序列為SEQ ID NO.28，探針包括：名稱為P14，序列為SEQ ID NO.56；

[0024]針對(duì)CD68基因的引物包括：名稱為F15，序列為SEQ ID NO.29，名稱為R15，序列為SEQ ID NO.30，探針包括：名稱為P15，序列為SEQ ID NO.57；

[0025]針對(duì)GSTM1基因的引物包括：名稱為F16，序列為SEQ ID NO.31，名稱為R16，序列為SEQ ID NO.32，探針包括：名稱為P16，序列為SEQ ID NO.58；

[0026]針對(duì)ACTB基因的引物包括：名稱為F17，序列為SEQ ID NO.33，名稱為R17，序列為SEQ ID NO.34，探針包括：名稱為P17，序列為SEQ ID NO.59；

[0027]針對(duì)GAPDH基因的引物包括：名稱為F18，序列為SEQ ID NO.35，名稱為R18，序列為SEQ ID NO.36，探針包括：名稱為P18，序列為SEQ ID NO.60；

[0028]針對(duì)GUS基因的引物包括：名稱為F19，序列為SEQ ID NO.37，名稱為R19，序列為SEQ ID NO.38，探針包括：名稱為P19，序列為SEQ ID NO.61；

[0029]針對(duì)RPLP0基因的引物包括：名稱為F20，序列為SEQ ID NO.39，名稱為R20，序列為SEQ ID NO.40，探針包括：名稱為P20，序列為SEQ ID NO.62；

[0030]針對(duì)TFRC基因的引物包括：名稱為F21，序列為SEQ ID NO.41，名稱為R21，序列為SEQ ID NO.42，探針包括：名稱為P21，序列為SEQ ID NO.63。

[0031]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒，熒光基團(tuán)包括：FAM，HEX，ROX，Cy5；淬滅基團(tuán)為MGB。

[0032]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒，6管反應(yīng)體系包括：反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI；

[0033]反應(yīng)液I包括：F1，R1，P1，F(xiàn)2，R2，P2，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)4，R4，P4；

[0034]反應(yīng)液II包括：F5，R5，P5，F(xiàn)6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)8，R8，P8；

[0035]反應(yīng)液III包括：F9，R9，P9，F(xiàn)10，R10，P10，F(xiàn)11，R11，P11；

[0036]反應(yīng)液IV包括：F12，R12，P12，F(xiàn)13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14；

[0037]反應(yīng)液V包括：F15，R15，P15，F(xiàn)16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，F(xiàn)18，R18，P18；

[0038]反應(yīng)液VI包括：F19，R19，P19，F(xiàn)20，R20，P20，F(xiàn)21，R21，P21。

[0039]一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

[0040]一，設(shè)計(jì)引物探針：

[0041]根據(jù)乳腺癌21基因設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan-MGB探針；

[0042]乳腺癌21基因包括：STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1、Ki67(MKI67)、MYBL2、HER2(ERBB2)、GRB7、BCL2、ER、PGR、SCUBE2、MMP11、CTSL2、GSTM1、CD68、BAG1、ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；

[0043]針對(duì)AURKA基因的引物包括：名稱為F1，序列為SEQ ID NO.01，名稱為R1，序列為SEQ ID NO.02；探針包括：名稱為P1，序列為SEQ ID NO.43；

[0044]針對(duì)BIRC5基因的引物包括：名稱為F2，序列為SEQ ID NO.03，名稱為R2，序列為SEQ ID NO.04，探針包括：名稱為P2，序列為SEQ ID NO.44；

[0045]針對(duì)CCNB1基因的引物包括：名稱為F3，序列為SEQ ID NO.05，名稱為R3，序列為SEQ ID NO.06，探針包括：名稱為P3，序列為SEQ ID NO.45；

[0046]針對(duì)Ki67基因的引物包括：名稱為F4，序列為SEQ ID NO.07，名稱為R4，序列為SEQ ID NO.08，探針包括：名稱為P4，序列為SEQ ID NO.46；

[0047]針對(duì)MYBL2基因的引物包括：名稱為F5，序列為SEQ ID NO.09，名稱為R5，序列為SEQ ID NO.10，探針包括：名稱為P5，序列為SEQ ID NO.47；

[0048]針對(duì)ERBB2基因的引物包括：名稱為F6，序列為SEQ ID NO.11，名稱為R6，序列為SEQ ID NO.12，探針包括：名稱為P6，序列為SEQ ID NO.48；

[0049]針對(duì)GRB7基因的引物包括：名稱為F7，序列為SEQ ID NO.13，名稱為R7，序列為SEQ ID NO.14，探針包括：名稱為P7，序列為SEQ ID NO.49；

[0050]針對(duì)BCL2基因的引物包括：名稱為F8，序列為SEQ ID NO.15，名稱為R8，序列為SEQ ID NO.16，探針包括：名稱為P8，序列為SEQ ID NO.50；

[0051]針對(duì)ER基因的引物包括：名稱為F9，序列為SEQ ID NO.17，名稱為R9，序列為SEQ ID NO.18，探針包括：名稱為P9，序列為SEQ ID NO.51；

[0052]針對(duì)PGR基因的引物包括：名稱為F10，序列為SEQ ID NO.19，名稱為R10，序列為SEQ ID NO.20，探針包括：名稱為P10，序列為SEQ ID NO.52；

[0053]針對(duì)SCUBE2基因的引物包括：名稱為F11，序列為SEQ ID NO.21，名稱為R11，序列為SEQ ID NO.22，探針包括：名稱為P11，序列為SEQ ID NO.53；

[0054]針對(duì)CTSL2基因的引物包括：名稱為F12，序列為SEQ ID NO.23，名稱為R12，序列為SEQ ID NO.24，探針包括：名稱為P12，序列為SEQ ID NO.54；

[0055]針對(duì)MMP11基因的引物包括：名稱為F13，序列為SEQ ID NO.25，名稱為R13，序列為SEQ ID NO.26，探針包括：名稱為P13，序列為SEQ ID NO.55；

[0056]針對(duì)BAG1基因的引物包括：名稱為F14，序列為SEQ ID NO.27，名稱為R14，序列為SEQ ID NO.28，探針包括：名稱為P14，序列為SEQ ID NO.56；

[0057]針對(duì)CD68基因的引物包括：名稱為F15，序列為SEQ ID NO.29，名稱為R15，序列為SEQ ID NO.30，探針包括：名稱為P15，序列為SEQ ID NO.57；

[0058]針對(duì)GSTM1基因的引物包括：名稱為F16，序列為SEQ ID NO.31，名稱為R16，序列為SEQ ID NO.32，探針包括：名稱為P16，序列為SEQ ID NO.58；

[0059]針對(duì)ACTB基因的引物包括：名稱為F17，序列為SEQ ID NO.33，名稱為R17，序列為SEQ ID NO.34，探針包括：名稱為P17，序列為SEQ ID NO.59；

[0060]針對(duì)GAPDH基因的引物包括：名稱為F18，序列為SEQ ID NO.35，名稱為R18，序列為SEQ ID NO.36，探針包括：名稱為P18，序列為SEQ ID NO.60；

[0061]針對(duì)GUS基因的引物包括：名稱為F19，序列為SEQ ID NO.37，名稱為R19，序列為SEQ ID NO.38，探針包括：名稱為P19，序列為SEQ ID NO.61；

[0062]針對(duì)RPLP0基因的引物包括：名稱為F20，序列為SEQ ID NO.39，名稱為R20，序列為SEQ ID NO.40，探針包括：名稱為P20，序列為SEQ ID NO.62；

[0063]針對(duì)TFRC基因的引物包括：名稱為F21，序列為SEQ ID NO.41，名稱為R21，序列為SEQ ID NO.42，探針包括：名稱為P21，序列為SEQ ID NO.63；

[0064]步驟二，提取樣品RNA；

[0065]步驟三，將對(duì)應(yīng)于21個(gè)基因的引物探針?lè)值?管反應(yīng)體系，每管檢測(cè)3-4種基因，標(biāo)記3-4種熒光基團(tuán)，使用一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行檢測(cè)；

[0066]步驟四，RS計(jì)算；

[0067]第一步：對(duì)16個(gè)基因的表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)各基因與5個(gè)參考基因的CT值差得到，標(biāo)準(zhǔn)化后的值在0-15；

[0068]第二步：計(jì)算組得分，

[0069]HER2分組值(HS)＝0.9*GRB7+0.1*HER2，如果小于8，則取8；

[0070]雌激素相關(guān)基因分值(ES)＝(0.8*ER+1.2*PGR+BCL2+SCUBE2)/4；

[0071]增殖相關(guān)基因組分值(PS)＝(BIRC5+MKI67+MYBL2+CCNB1+AURKA)/5，如果小于

6.5，則取6.5；

[0072]侵襲相關(guān)基因組分值(IS)＝(CTSL2+MMP11)/2；

[0073]未矯正的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值為RSU：

[0074]RSU＝+0.47*HS-0.34*ES+1.04*PS+0.10*IS+0.05*CD68-0.08GSTM1-0.07*BAG1；

[0075]復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值RS：

[0076]如果RSU在0和100范圍內(nèi)，RS＝20*(RSU-6.7)；

[0077]如果RSU小于0，RS＝0；

[0078]如果RSU大于100，RS＝100；

[0079]如果RS<18，屬于低風(fēng)險(xiǎn)；

[0080]如果18<rs<31，屬于中風(fēng)險(xiǎn)；

[0081]如果RS>31，屬于高風(fēng)險(xiǎn)。

[0082]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，

[0083]步驟二，提取樣品RNA；

[0084]用RNA提取試劑盒對(duì)新鮮病理組織進(jìn)行提取，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，所提RNA的A260/A280應(yīng)在1.8-2.0之間。

[0085]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，合成好的引物和探針使用pH為

8.3的Tris-HCl進(jìn)行溶解。

[0086]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，6管反應(yīng)體系包括：反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI；

[0087]反應(yīng)液I包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)1，R1，P1，F(xiàn)2，R2，P2，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)4，R4，P4，模板；

[0088]反應(yīng)液II包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)5，R5，P5，F(xiàn)6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)8，R8，P8，模板；

[0089]反應(yīng)液III包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)9，R9，P9，F(xiàn)10，R10，P10，F(xiàn)11，R11，P11，模板；

[0090]反應(yīng)液IV包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)12，R12，P12，F(xiàn)13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14，模板；

[0091]反應(yīng)液V包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)15，R15，P15，F(xiàn)16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，F(xiàn)18，R18，P18，模板；

[0092]反應(yīng)液VI包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)19，R19，P19，F(xiàn)20，R20，P20，F(xiàn)21，R21，P21，模板。

[0093]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，6管反應(yīng)體系包括：反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI；

[0094]反應(yīng)液I包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)1，R1，P1，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)9，R9，P9，模板；

[0095]反應(yīng)液II包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)12，R12，P12，F(xiàn)18，R18，P18，模板；

[0096]反應(yīng)液III包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)2，R2，P2，F(xiàn)10，R10，P10，F(xiàn)11，R11，P11，模板；

[0097]反應(yīng)液IV包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14，F(xiàn)20，R20，P20，模板；

[0098]反應(yīng)液V包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)8，R8，P8，F(xiàn)15，R15，P15，F(xiàn)16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，模板；

[0099]反應(yīng)液VI包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)4，R4，P4，F(xiàn)5，R5，P5，F(xiàn)19，R19，P19，F(xiàn)21，R21，P21，模板。

[0100]前述的一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，6管反應(yīng)體系包括：反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI；

[0101]反應(yīng)液I包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)2，R2，P2，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)11，R11，P11，F(xiàn)15，R15，P15，模板；

[0102]反應(yīng)液II包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)5，R5，P5，F(xiàn)6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)8，R8，P8，模板；

[0103]反應(yīng)液III包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)4，R4，P4，F(xiàn)9，R9，P9，F(xiàn)10，R10，P10，模板；

[0104]反應(yīng)液IV包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)12，R12，P12，F(xiàn)13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14，F(xiàn)19，R19，P19，模板；

[0105]反應(yīng)液V包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，F(xiàn)18，R18，P18，模板；

[0106]反應(yīng)液VI包括：一步法RT-PCR Mix，F(xiàn)1，R1，P1，F(xiàn)20，R20，P20，F(xiàn)21，R21，P21，模板。

[0107]本發(fā)明的有益之處在于：

[0108]本發(fā)明優(yōu)化了多重逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)體系，使得21個(gè)基因可以在6管反應(yīng)中得到準(zhǔn)確檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)通量，節(jié)省了成本，降低了檢測(cè)時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)操作的難度；

[0109]體系通過(guò)優(yōu)化和篩選，達(dá)到了較高靈敏度，且特異性強(qiáng)；

[0110]本發(fā)明使用一步法多重RT-PCR，不需要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，簡(jiǎn)化了樣本制備過(guò)程，同時(shí)避免cDNA污染。

附圖說(shuō)明

[0111]圖1是本發(fā)明檢測(cè)方法的一種實(shí)施例的流程圖；

[0112]圖2是本發(fā)明檢測(cè)1例高風(fēng)險(xiǎn)樣本的結(jié)果圖；

[0113]圖3是本發(fā)明檢測(cè)1例低風(fēng)險(xiǎn)樣本的結(jié)果圖；

[0114]圖4是本發(fā)明高風(fēng)險(xiǎn)樣本檢測(cè)靈敏度的結(jié)果圖；

[0115]圖5是本發(fā)明低風(fēng)險(xiǎn)樣本檢測(cè)靈敏度的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

[0116]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。

[0117]如圖1所示，一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

[0118](1)引物探針設(shè)計(jì)

[0119]從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載21基因序列，具體為16個(gè)癌癥相關(guān)基因和5個(gè)參考基因，癌癥相關(guān)基因分為5組：增殖相關(guān)基因組，包括Ki67(MKI67)、STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1和MYBL2；表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)基因組，包括GRB7和HER2；激素相關(guān)基因組，包括ER、PgR、BCL2和SCUBE2；浸潤(rùn)相關(guān)基因組，包括MMP11和CTSL2以及3個(gè)未分類基因GSTM1、CD68和BAG1。5個(gè)參考基因分別為ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC。依據(jù)設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan-MGB探針，序列如表4中的SEQ ID NO.01-SEQ ID NO.63，引物探針順序是按照表1的各基因順序排列。

[0120]表1：21基因檢測(cè)分管情況

[0121]

[0122]表2：21基因檢測(cè)分管情況

[0123]

[0124]表3：21基因檢測(cè)分管情況

[0125]

[0126]將21個(gè)基因分到6管反應(yīng)體系，每管檢測(cè)3-4種基因，標(biāo)記3-4種熒光基團(tuán)，使用一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)軟件給出的CT值，用復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分算法計(jì)算復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值RS。引物和探針均由專業(yè)公司合成并純化，合成好的引物和探針使用Tris-HCl(pH 8.3)進(jìn)行溶解，并用NanoReady紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，最后稀釋至50μM，分裝并保存在-20℃冰箱。

[0127]表4：21基因的引物探針序列信息

[0128]

[0129]

[0130](2)RNA提取

[0131]新鮮病理組織使用TIANGEN的RNA提取試劑盒進(jìn)行提??；石蠟包埋組織或切片，建議采用Qiagen公司的FFPE組織RNA提取試劑盒(RNeasy FFPE Kit)進(jìn)行提取。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，所提RNA的A260/A280應(yīng)在1.8-2.0之間，提取后的RNA應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè)，或溶于0.1％DEPC水中，若暫時(shí)不用請(qǐng)于-70℃以下保存。

[0132](3)PCR反應(yīng)體系

[0133]作為一種實(shí)施例，6管反應(yīng)體系包括：反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI；

[0134]反應(yīng)液I包括：F1，R1，P1，F(xiàn)2，R2，P2，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)4，R4，P4；

[0135]反應(yīng)液II包括：F5，R5，P5，F(xiàn)6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)8，R8，P8；

[0136]反應(yīng)液III包括：F9，R9，P9，F(xiàn)10，R10，P10，F(xiàn)11，R11，P11；

[0137]反應(yīng)液IV包括：F12，R12，P12，F(xiàn)13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14；

[0138]反應(yīng)液V包括：F15，R15，P15，F(xiàn)16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，F(xiàn)18，R18，P18；

[0139]反應(yīng)液VI包括：F19，R19，P19，F(xiàn)20，R20，P20，F(xiàn)21，R21，P21。

[0140]具體的反應(yīng)體系按表5-1、表6-1、表7-1、表8-1、表9-1和表10-1的用量分別配制PCR反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI，每個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)的基因如表1。

[0141]需要說(shuō)明的是：反應(yīng)體系的引物探針的組合并非只有這一種，也可以是以下組合：

[0142]作為一種實(shí)施例，反應(yīng)體系的引物探針的組合可以是：

[0143]反應(yīng)液I包括：F1，R1，P1，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)9，R9，P9，分別標(biāo)記FAM、ROX、HEX；

[0144]反應(yīng)液II包括：F6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)12，R12，P12，F(xiàn)18，R18，P18，分別標(biāo)記HEX、ROX、FAM、Cy5；

[0145]反應(yīng)液III包括：F2，R2，P2，F(xiàn)10，R10，P10，F(xiàn)11，R11，P11，分別標(biāo)記HEX、FAM、ROX；

[0146]反應(yīng)液IV包括：F13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14，F(xiàn)20，R20，P20，分別標(biāo)記HEX、ROX、FAM；

[0147]反應(yīng)液V包括：F8，R8，P8，F(xiàn)15，R15，P15，F(xiàn)16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，分別標(biāo)記Cy5、FAM、HEX、ROX；

[0148]反應(yīng)液VI包括：F4，R4，P4，F(xiàn)5，R5，P5，F(xiàn)19，R19，P19，F(xiàn)21，R21，P21，分別標(biāo)記Cy5、FAM、HEX、ROX。

[0149]具體的反應(yīng)體系按表5-2、表6-2、表7-2、表8-2、表9-2和表10-2的用量分別配制PCR反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI，每個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)的基因如表2。

[0150]作為一種實(shí)施例，反應(yīng)體系的引物探針的組合還可以是：

[0151]反應(yīng)液I包括：F2，R2，P2，F(xiàn)3，R3，P3，F(xiàn)11，R11，P11，F(xiàn)15，R15，P15，分別標(biāo)記HEX、ROX、FAM、Cy5；

[0152]反應(yīng)液II包括：F5，R5，P5，F(xiàn)6，R6，P6，F(xiàn)7，R7，P7，F(xiàn)8，R8，P8，分別標(biāo)記FAM、HEX、ROX、Cy5；

[0153]反應(yīng)液III包括：F4，R4，P4，F(xiàn)9，R9，P9，F(xiàn)10，R10，P10，分別標(biāo)記Cy5、FAM、HEX；

[0154]反應(yīng)液IV包括：F12，R12，P12，F(xiàn)13，R13，P13，F(xiàn)14，R14，P14，F(xiàn)19，R19，P19，分別標(biāo)記FAM、HEX、ROX、Cy5；

[0155]反應(yīng)液V包括：F16，R16，P16，F(xiàn)17，R17，P17，F(xiàn)18，R18，P18，分別標(biāo)記HEX、ROX、FAM；

[0156]反應(yīng)液VI包括：F1，R1，P1，F(xiàn)20，R20，P20，F(xiàn)21，R21，P21，分別標(biāo)記FAM、HEX、ROX。

[0157]需要說(shuō)明的是：這些舉例并非全部可能性，在此無(wú)法窮舉，只要是本發(fā)明提出的引物探針的組合都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

[0158]具體的反應(yīng)體系按表5-3、表6-3、表7-3、表8-3、表9-3和表10-3的用量分別配制PCR反應(yīng)液I、反應(yīng)液II、反應(yīng)液III、反應(yīng)液IV、反應(yīng)液V和反應(yīng)液VI，每個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)的基因如表3。

[0159]表5-1 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液I)

[0160]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF1 0.6μMR1 0.6μMP1 0.3μMF2 0.5μMR2 0.5μMP2 0.3μMF3 0.6μMR3 0.6μMP3 0.3μMF4 0.7μMR4 0.7μMP4 0.5μM模板 2μl總體積 20μl

[0161]表6-1PCR體系各成分組成(反應(yīng)液II)

[0162]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF5 0.5μMR5 0.5μMP5 0.2μMF6 0.6μMR6 0.6μMP6 0.3μMF7 0.6μMR7 0.6μMP7 0.4μMF8 0.5μMR8 0.5μMP8 0.2μM模板 2μl總體積 20μl

[0163]表7-1 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液III)

[0164]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF9 0.4μMR9 0.4μMP9 0.2μMF10 0.5μMR10 0.5μMP10 0.4μMF11 0.6μMR11 0.6μMP11 0.6μM模板 2μl總體積 20μl

[0165]表8-1 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液IV)

[0166]

[0167]

[0168]表9-1 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液V)

[0169]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF15 0.7μMR15 0.7μMP15 0.5μMF16 0.6μMR16 0.6μMP16 0.5μMF17 0.6μMR17 0.6μMP17 0.5μMF18 0.6μMR18 0.6μMP18 0.5μM模板 2μl總體積 20μl

[0170]表10-1 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液VI)

[0171]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF19 0.4μMR19 0.4μMP19 0.3μMF20 0.5μMR20 0.5μMP20 0.5μMF21 0.6μMR21 0.6μMP21 0.6μM模板 2μl總體積 20μl

[0172]表5-2 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液I)

[0173]

[0174]

[0175]表6-2 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液II)

[0176]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF6 0.5μMR6 0.5μMP6 0.2μMF7 0.7μMR7 0.7μMP7 0.4μMF12 0.5μMR12 0.5μMP12 0.5μMF18 0.6μMR18 0.6μMP18 0.3μM模板 2μl總體積 20μl

[0177]表7-2 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液III)

[0178]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF2 0.4μMR2 0.4μMP2 0.2μMF10 0.5μMR10 0.5μMP10 0.5μMF11 0.5μMR11 0.5μMP11 0.25μM模板 2μl總體積 20μl

[0179]表8-2 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液IV)

[0180]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF13 0.8μMR13 0.8μMP13 0.4μMF14 0.6μMR14 0.6μMP14 0.3μMF20 0.5μMR20 0.5μMP20 0.2μM模板 2μl總體積 20μl

[0181]表9-2 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液V)

[0182]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF8 0.7μMR8 0.7μMP8 0.5μMF15 0.6μMR15 0.6μMP15 0.5μMF16 0.4μMR16 0.4μMP16 0.2μMF17 0.6μMR17 0.6μMP17 0.5μM模板 2μl總體積 20μl

[0183]表10-2 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液VI)

[0184]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF4 0.6μMR4 0.6μMP4 0.3μMF5 0.4μMR5 0.4μMP5 0.4μMF19 0.6μMR19 0.6μMP19 0.2μMF21 0.8μMR21 0.8μMP21 0.4μM模板 2μl總體積 20μl

[0185]表5-3 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液I)

[0186]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF2 0.5μMR2 0.5μMP2 0.3μMF3 0.6μMR3 0.6μMP3 0.3μMF11 0.5μMR11 0.5μMP11 0.5μMF15 0.6μMR15 0.6μMP15 0.3μM模板 2μl總體積 20μl

[0187]表6-3 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液II)

[0188]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF5 0.5μMR5 0.5μMP5 0.2μMF6 0.6μMR6 0.6μMP6 0.3μMF7 0.6μMR7 0.6μMP7 0.4μMF8 0.8μMR8 0.8μMP8 0.2μM模板 2μl總體積 20μl

[0189]表7-3 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液III)

[0190]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF4 0.5μMR4 0.5μMP4 0.5μMF9 0.6μMR9 0.6μMP9 0.3μMF10 0.5μMR10 0.5μMP10 0.4μM模板 2μl總體積 20μl

[0191]表8-3 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液IV)

[0192]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF12 0.7μMR12 0.7μMP12 0.4μMF13 0.5μMR13 0.5μMP13 0.2μMF14 0.5μMR14 0.5μMP14 0.3μMF19 0.8μMR19 0.8μMP19 0.4μM模板 2μl總體積 20μl

[0193]表9-3 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液V)

[0194]

[0195]

[0196]表10-3 PCR體系各成分組成(反應(yīng)液VI)

[0197]各組分名稱 終濃度或終體積一步法RT-PCR Mix 1μlF1 0.5μMR1 0.5μMP1 0.3μMF20 0.5μMR20 0.5μMP20 0.5μMF21 0.6μMR21 0.6μMP21 0.3μM模板 2μl總體積 20μl

[0198](4)反應(yīng)程序設(shè)定

[0199]表11 PCR程序

[0200]

[0201]注：58℃時(shí)采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道的熒光。

[0202](5)加樣上機(jī)

[0203]a).檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

[0204]將一份高風(fēng)險(xiǎn)和一份低風(fēng)險(xiǎn)RNA樣本用RNase free水稀釋到1ng/μL，備用。按每反應(yīng)孔18μL將PCR反應(yīng)液分裝到PCR八連排中，加2μL模板RNA，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)2次。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，將模板替換成0.1％DEPC水。選擇SLAN96P熒光PCR儀，按設(shè)定程序運(yùn)行。

[0205]b).臨床樣本檢測(cè)：

[0206]按每反應(yīng)孔18μL分裝到PCR八連排中，加2μL模板RNA，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)2次。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，將模板替換成0.1％DEPC水。選擇SLAN96P熒光PCR儀，按設(shè)定程序運(yùn)行。

[0207](6)RS計(jì)算第一步：對(duì)16個(gè)基因的表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)各基因與5個(gè)參考基因的CT值差得到，標(biāo)準(zhǔn)化后的值在0-15；第二步：計(jì)算組得分，

[0208]HER2分組值(HS)＝0.9*GRB7+0.1*HER2，如果小于8，則取8；

[0209]雌激素相關(guān)基因分值(ES)＝(0.8*ER+1.2*PGR+BCL2+SCUBE2)/4；

[0210]增殖相關(guān)基因組分值(PS)＝(BIRC5+MKI67+MYBL2+CCNB1+AURKA)/5，如果小于

6.5，則取6.5；

[0211]侵襲相關(guān)基因組分值(IS)＝(CTSL2+MMP11)/2；

[0212]未矯正的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值為RSU：

[0213]RSU＝+0.47*HS-0.34*ES+1.04*PS+0.10*IS+0.05*CD68-0.08GSTM1-0.07*BAG1；

[0214]復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值RS：

[0215]如果RSU在0和100范圍內(nèi)，RS＝20*(RSU-6.7)；

[0216]如果RSU小于0，RS＝0；

[0217]如果RSU大于100，RS＝100；

[0218]如果RS<18，屬于低風(fēng)險(xiǎn)；

[0219]如果18<rs<31，屬于中風(fēng)險(xiǎn)；

[0220]如果RS>31，屬于高風(fēng)險(xiǎn)。

[0221]根據(jù)以上算法，將16個(gè)癌相關(guān)基因的CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后換算成RS值，得到結(jié)果如下：附圖2為本發(fā)明檢測(cè)1例高風(fēng)險(xiǎn)樣本的PCR結(jié)果圖，表12為相對(duì)應(yīng)的RS值計(jì)算結(jié)果，RS為78.05，屬于高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；附圖3為本發(fā)明檢測(cè)1例低風(fēng)險(xiǎn)樣本的PCR結(jié)果圖，表13為對(duì)應(yīng)的RS值計(jì)算結(jié)果，RS為16.8，屬于低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；附圖4為本發(fā)明對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)樣本檢測(cè)靈敏度PCR結(jié)果圖，表14為對(duì)應(yīng)的RS值計(jì)算結(jié)果，RS為70.0，屬于高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；附圖5為本發(fā)明對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)樣本檢測(cè)靈敏度PCR結(jié)果圖，表15為對(duì)應(yīng)的RS值計(jì)算結(jié)果，RS為14.9，屬于低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

[0222]表12

[0223]

[0224]表13

[0225]

[0226]表14

[0227]

[0228]表15

[0229]

[0230]本發(fā)明試劑盒特異性良好，主要是通過(guò)嚴(yán)格把控檢測(cè)引物的特異性實(shí)現(xiàn)，例如現(xiàn)有專利CN107058523A中ACTB和GSTM1基因的引物除了特異性擴(kuò)增ACTB和GSTM1基因之外，在人類RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中存在其他高度相似序列，如ACTB基因的引物會(huì)延伸出ACTG1、KANTR和ACTG1P4基因的片段。另外，GSTM1基因的引物同樣可以延伸出GSTM2、GSTM4、GSTM5和GSTM2P1基因的片段，這些非特異片段的產(chǎn)生會(huì)對(duì)相應(yīng)基因的表達(dá)量產(chǎn)生干擾，造成mRNA表達(dá)量定量不準(zhǔn)確，從而進(jìn)一步影響RS值計(jì)算結(jié)果。本試劑盒21基因引物特異性均經(jīng)過(guò)NCBI-BLAST驗(yàn)證，ACTB和GSTM1兩個(gè)基因的引物對(duì)在人類RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在高度相似的非特異區(qū)域，只特異性擴(kuò)增ACTB和GSTM1兩個(gè)基因，而且其余19個(gè)基因的引物也同樣具有良好的特異性，使得試劑盒具有更優(yōu)的特異性。

[0231]本發(fā)明使用一步法多重RT-PCR，不需要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，簡(jiǎn)化了樣本制備過(guò)程，同時(shí)避免cDNA污染。采用特異引物、TaqMan-MGB探針結(jié)合一步法多重RT-PCR技術(shù)，僅在6管反應(yīng)中即可對(duì)21個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)通量高，一塊96孔板可同時(shí)檢測(cè)超過(guò)10份的臨床樣本，本試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、成本低。

[0232]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。25序　列　表序列表<110> 合肥仁創(chuàng)基因生物科技有限公司<120> 一種乳腺癌21基因檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法<141> 2019-11-