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文獻分享——NCB-干細胞移植早期的"黑匣子"

內(nèi)容目錄

前言科學(xué)問題背景知識干細胞相關(guān)CellTrace VioletPVA-培養(yǎng)成熟血細胞分裂情況PART1-小鼠單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜HSC細胞群MPP及其他成熟細胞群小結(jié)PART2-移植HSC的分化小結(jié)PART3-移植HSC動態(tài)分化成HSC和MPPHSCMPP小思考PART4-功能驗證小結(jié)PART5-移植的HSC分化出紅、髓系前體細胞討論疑問后記

前言

5.4青年節(jié)那天，課題組3年半的工作在NCB上發(fā)表，并且在公眾號上得到報道：

特別推薦NCB | 程濤/朱平等合作打開干細胞移植早期的“黑匣子”

在我整理的過程中，又有推文詳細介紹了這篇文章：

Nature CellBio. | 單細胞基因組測序追蹤造血干細胞分化

關(guān)于移植后干細胞的動力學(xué)問題，課題組最早報道了預(yù)處理的損傷受體環(huán)境對于供體移植HSC有負性作用的“旁觀者”效應(yīng)。但是局限于當時技術(shù)的發(fā)展，未能進一步探索。正所謂生物界內(nèi)絕大多數(shù)的突破都得益于技術(shù)的突破，這里也是一樣的。因為單細胞這種新技術(shù)的出現(xiàn)，讓我們可以在更高的分辨率下去觀察移植后HSC的變化。

現(xiàn)在隨著單細胞技術(shù)的出現(xiàn)，對于HSC在骨髓歸巢后如何增殖、分化并重建整個造血的動態(tài)過程也逐漸有了新的見解。

雖然目前不做這方面，但是干細胞知識還是要多學(xué)習(xí)，多了解課題組的研究方向才是，所以，趁著在家，把這篇文章的筆記給做一做吧！

為防止內(nèi)容過多，大家不愿往下看，所以：

• 用單細胞技術(shù)分群，建立了28個造血亞群（比較模糊，如果不做單細胞數(shù)據(jù)分析，可以忽略。但是如果做數(shù)據(jù)分析，可以好好看一看，最好拿到數(shù)據(jù)，這樣在你們的單細胞分析過程中，你們的群定義就會非常的方便?。?/p>

• 歸巢到骨髓和脾臟的HSC絕大多數(shù)變成了MPP，部分分化為MEP以及CMP。

• 移植后一周內(nèi)，HSC主要進行分化，而不擴增。

不想仔細看的就可以結(jié)束觀看了喲~

科學(xué)問題

我們都知道移植病人進行移植前需要進行放化療預(yù)處理，這種預(yù)處理可能會引起“旁觀者”效應(yīng)。簡單來說所謂的“旁觀者”效應(yīng)就是指：放化療后引起骨髓微環(huán)境出現(xiàn)細胞因子、炎癥、活性氧ROS等一系列有害的因素，這種有害的環(huán)境會對即將進行移植的HSC產(chǎn)生有害的影響，也就是所謂的“旁觀者”效應(yīng)了。

既然存在“旁觀者”效應(yīng)，那么在“旁觀者”效應(yīng)下，移植進去的HSC會發(fā)生什么變化呢？這就是這篇文章的出發(fā)點了。

Wang  et al.在2011年的一篇nature review中推斷，經(jīng)歷清髓處理后，當移植了HSC時，為了滿足機體對于血細胞的需求，HSC會大量擴增，然后才向下分化。但是因為在剛剛移植后的病人體內(nèi)早期難以獲得足夠量的骨髓細胞，所以一直沒人能夠?qū)@個說法進行驗證。因為前面提到的單細胞技術(shù)的出現(xiàn)，才給了我們這樣的機會去探索。

這里想起一個經(jīng)典問題——你的研究有沒有必要用單細胞？這個研究中，我覺得單細胞是必須的了！

背景知識

干細胞相關(guān)

1. 在小鼠模型中，HSC移植最早產(chǎn)生血小板，在移植后7-9天即可出現(xiàn)。

2. 關(guān)于文中流式分選使用的marker策略：

還是非常的細致的！

CellTrace Violet

CellTrace Violet是一種親脂性膜染料，在細胞分裂時在子細胞之間大致均分，從而使標記的熒光強度減半。

PVA-培養(yǎng)

這個是2019年一篇發(fā)表在nature上的工作，介紹了一種體外擴增干細胞的無血清蛋白培養(yǎng)體系。具體文章地址：

https://www./articles/s41586-019-1244-x

一些背景知識：

小牛血清（Fetal Bovine/Calf Serum，F(xiàn)BS，F(xiàn)CS）、純化白蛋白或重組白蛋白都會破壞造血干細胞未分化狀態(tài)的維持。但是，如果培養(yǎng)基中不添加白蛋白等蛋白質(zhì)組分，造血干細胞的細胞分裂誘導(dǎo)又成問題。

簡單讀了后，簡單歸納下：

1. 主要是針對小鼠的HSC培養(yǎng)。

2. 確定高水平的TPO、低水平的SCF和纖粘蛋白對于維持HSC的自我更新非常重要?？梢约饶?strong style="font-size: inherit;color: inherit;line-height: inherit;">保持干細胞特性又能長時間高效培養(yǎng)。

3. 培養(yǎng)HSC時需要加入血清白蛋白，但是對于血清蛋白來說，這可能是培養(yǎng)過程中污染的一個主要來源。于是用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）來代替血清白蛋白。

4. 結(jié)果顯示這種培養(yǎng)體系一個月內(nèi)可以讓HSC擴增能力升高236-899倍，不過體外培養(yǎng)時細胞擴增能力的異質(zhì)性較大。

5. 最后文中得到的最佳培養(yǎng)體系：100 ng/ml TPO, 10 ng-ml SCF and 87% PVA on fibronectin：

看完后發(fā)現(xiàn)，原來已經(jīng)有推文給整理好了！

《自然》：重大突破！普通膠水破解困擾醫(yī)學(xué)界50年的歷史性難題，科學(xué)家借助膠水首次實現(xiàn)造血干細胞體外千倍擴增丨科學(xué)大發(fā)現(xiàn)

成熟血細胞分裂情況

• 成熟的巨核細胞是可以有絲分裂的（成熟紅細胞是不能有絲分裂的，畢竟連核都沒了，拿什么分）

• 成熟的粒細胞是可以有絲分裂的

• 成熟的單核細胞在向巨噬細胞轉(zhuǎn)變時是可以有絲分裂的

• 成熟的淋巴細胞不能有絲分裂

當然了，這里淋巴細胞說不能分裂不是絕對的，因為就像肝臟細胞，平常也是不怎么分裂的，但是在外界應(yīng)急條件下，還是會進行劇烈的擴增分裂的。

PART1-小鼠單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

1. 用成年C57BL/6小鼠的骨髓和脾臟細胞進行單細胞RNA-seq，建立了一個有28群造血細胞的單細胞圖譜：

HSC細胞群

2. 在免疫表型定義的HSC（iHSCs）中，用單細胞技術(shù)來看，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)異質(zhì)性非常明顯，通過生信角度的分析，將5組免疫表型上的iHSCs歸為了3組轉(zhuǎn)錄組水平的HSC（tHSCs）：

3. 對這3組tHSCs進行UMAP降維展示，發(fā)現(xiàn)分的非常開：

4. 同樣，又展示了下這3群tHSCs的特異性marker基因：

• tHSC1：Egr1，Nr4a1

• tHSC2：Sh3gl1，S100a9

• tHSC3：Cd79a，Blnk

1. 常規(guī)分析下轉(zhuǎn)錄組上定義的HSC（tHSCs）和免疫表型定義的HSC（iHSCs）之間的數(shù)量占比：

• tHSC1：比較雜，5種iHSCs類型都有

• tHSC2：比較雜，有4種iHSCs類型，缺乏FractionⅢ

• tHSC3：≥85%的都是FractionⅢ

1. 又反過來看了一遍：

注意：上圖ef兩個圖都是百分比關(guān)系，所以在e中我們認為≥85%的tHSC3都是FractionⅢ，但是在f圖里我們發(fā)現(xiàn)FractionⅢ最多的是tHSC1。

MPP及其他成熟細胞群

7. 用上述HSC細胞群的分析方法，又對MPP細胞群進行了相同的分析，將9組免疫表型上的iMPPs歸為了5組轉(zhuǎn)錄組水平tMPPs：

感覺不算很好看，但是也還好吧，可能是有的群之間比較像~

8. 同樣，常規(guī)分析下轉(zhuǎn)錄組上定義的MPP（tMPPs）和免疫表型定義的MPP（iMPPs）之間的數(shù)量占比：

結(jié)果還是一樣的，但是我這種顏色一多，我就會看花的人，覺得看著有些費力，正好這個文章附件里有原始數(shù)據(jù)，于是，我就非常笨拙的畫了個簡單的熱圖來看，因為圖2b和c其實用到的數(shù)據(jù)是同一個，所以用下面的熱圖來定性展示圖b和c的內(nèi)容：

9. 接下來對一些committed的祖細胞，簡寫為CP細胞（免疫表型上來看包括CMP、GMP、CLP和MEP）以及一些成熟細胞進行類似的分析，這些數(shù)據(jù)就放到了supplement了。

10. 小結(jié)下上面的數(shù)據(jù)：

• 5組iHSCs（HSC^LT、Fraction  I、Fraction III、ESLAM和ESLMASK）歸為了3組tHSCs

• 9組iMPPs（HSCST、LMPP、MPP1、MPP2、MPP3、MPP4、Fraction II、HPC2和HPC3）歸為了5組tMPPs

• 4組iCPs（ CMP、GMP、MEP和CLP）歸為了3組tCPs

• 3組成熟iMEs（ EryA、EryB和MK）歸為了3組tMEs

• 3組成熟iGMs（ Granulocyte、Macrophage和Monocyte）歸為了3組tGMs

• 4組成熟iLyms（ SP B cell、SP CD4 T cell、SP CD8 T cell和SP NK cell）歸為了4組tLyms

所以，一共有28組免疫表型的血細胞，分成了21組轉(zhuǎn)錄組血細胞。

評價：非常的細致

11. 看看這些細胞之間的細胞周期：

• tHSCs和tLyms大多是靜息態(tài)

• tMPPs和tCPs則變化較大，既有靜息態(tài)，又有分裂態(tài)的，而且兩者比例變化較大。

看到這里感覺和我已有知識發(fā)生了沖突，因為我既往認為是一些成熟的血細胞是不怎么分裂的，能分裂的都是來自干祖細胞的。根據(jù)上面這個圖來看我的知識需要更新了：

• 成熟的巨核細胞是可以有絲分裂的（成熟紅細胞是不能有絲分裂的，畢竟連核都沒了，拿什么分）

• 成熟的粒細胞是可以有絲分裂的

• 成熟的單核細胞在向巨噬細胞轉(zhuǎn)變時是可以有絲分裂的

• 成熟的淋巴細胞不能有絲分裂

當然了，這里淋巴細胞說不能分裂不是絕對的，因為就像肝臟細胞，平常也是不怎么分裂的，但是在外界應(yīng)急條件下，還是會進行劇烈的擴增分裂的。

12. 又對3個tHSCs進行GSEA分析，主要用到的gene set是干細胞相關(guān)的（第1-2個）以及分化相關(guān)的（第3-6個）：

• HSC信號相關(guān)的主要富集在tHSC1>tHSC2>tHSC3

• 靜息態(tài)主要富集在tHSC1>tHSC2>tHSC3

• 向MK分化的主要富集在tHSC1>tHSC2>tHSC3

• 向紅系分化的主要富集在tHSC3>tHSC1>tHSC2

• 向淋系分化的主要富集在tHSC1和tHSC3

說明這里tHSC1的話干性最強，和前面的周期分析相符。

13. 一樣的，分析完iHSCs，就得繼續(xù)分析iMPPs了：

• HSC信號相關(guān)的主要富集在tMPP1>tMPP2>tMPP5

• 增殖信號主要富集在tMPP3>tMPP5>tMPP2

• 向CLP分化的主要富集在tMPP5

• 向Pre-MK分化的主要富集在tMPP1和MPP2

• 向Pro-MK分化的主要富集在tMPP1和MPP2

• 向Pre-粒分化的主要富集在tMPP3

1. 通過Monocle的分析，發(fā)現(xiàn)iHSC3有點與眾不同：

別的tHSCs都在干細胞的位置，iHSC3跑去了更下游的地方。而且從上面的分析我們可以得知，其實iHSC3細胞組成上來說很多是FractionⅢ（關(guān)于這個其實我沒有讀過相關(guān)文獻，不是很清楚），既然研究證實FractionⅢ主要是有長期淋系重建能力的一群細胞。

所以說，也許iHSC3在功能上更像是ST-HSC或者MPP。

小結(jié)

整個fig1-2的話，其實就是給我們展示了正常小鼠骨髓和脾臟血細胞的一個完整的圖譜。一共有28組免疫表型的血細胞，分成了21組轉(zhuǎn)錄組血細胞。后面的一系列實驗都是基于這個定義來做的。

PART2-移植HSC的分化

有了上面的工作，那么就開始探索移植后的工作。

1. 將6-8周的雌鼠CD45.2用9.5Gy進行照射清髓，然后從正常帶有GFP熒光的CD45.2小鼠中將1000-4000個高度純化的骨髓中ESLAMSK細胞分選出來，與3*10⁵個全骨髓細胞混合后，通過尾靜脈移植到GFP-的CD45.2小鼠體內(nèi)。在移植后1，3，5，7天時從CD45.2小鼠中分離出GFP+的細胞來做scRNA-seq分析：

這里其實我覺得，可以用FractionⅠ？？因為從上面的數(shù)據(jù)中來看，FractionⅠ的話其實更多偏向于干細胞。當然了，在現(xiàn)實工作中，可能是先做了實驗，然后做的數(shù)據(jù)分析，所以也沒辦法吧。

2. 在移植后第1，3，5，7天收集的GFP+細胞數(shù)量非常非常低：

3. 而且從轉(zhuǎn)錄組上來看，和移植前的細胞相比，移植后得到的GFP+細胞在第一天就出現(xiàn)了明細的改變：

這就說明了，第一天開始，轉(zhuǎn)錄狀態(tài)就發(fā)生了改變。不過這個也不能說明問題，畢竟移植前進行了放射處理，微環(huán)境已經(jīng)發(fā)生了改變，旁觀者效應(yīng)也出現(xiàn)了。

4. 看問題不能只從一個角度，于是就從轉(zhuǎn)錄因子層面去看GFP+細胞的變化：

D0就是ESLAMSK細胞，可以看到在D1的時候從TF上來看就有變化了：

• Egr1，Egr3，Gata2，Hmga2這些和自我更新相關(guān)的TF都出現(xiàn)了明細的下調(diào)→自我更新降低

• 和髓系分化相關(guān)的TF（Cebpa，Cebpab，Cebpad，Cebpae）以及MK相關(guān)的TF（Irf2）上調(diào)

這都說明了在移植后早期，HSPCs的自我更新降低，而開始分化趨勢。

5. 那么，移植后在受體鼠內(nèi)的那些細胞和之前得到的穩(wěn)態(tài)細胞在轉(zhuǎn)錄組上是不是一樣的呢？利用前面的圖譜，將這次測序的數(shù)據(jù)和圖譜進行KNN算法的映射對應(yīng)：

看上去移植后的細胞和正常穩(wěn)態(tài)下的細胞還是一樣的，沒什么改變。

下面放一個降維后的分布圖：

這里可能需要提醒的一點是：

• 所謂的Homeostasis應(yīng)該是從正常小鼠體內(nèi)直接拿出來的細胞進行單細胞測序得來的

• Post transplantation則是移植GFP+的ESLAMSK細胞后，在體內(nèi)重建后拿出GFP+的細胞進行測序得來的

這些推斷可以從下面的圖中得到驗證吧。

6. 這里的Input細胞是指從供體得到的ESLAMSK細胞，而Output細胞則是指在受體鼠內(nèi)不同時間點的GFP+細胞：

• 細胞分化的非常快?。〖词故莿倓?strong style="font-size: inherit;color: inherit;line-height: inherit;">移植第1天，也已經(jīng)產(chǎn)生有tMEs，tGMs了！

• tHSC移植后第1天來看，數(shù)量立馬衰減，并且開始迅速分化?。?/p>

• 移植后第1天來看，在體內(nèi)tMPPs立馬稱為主體

• 移植后第1天來看，在體內(nèi)會出現(xiàn)一些成熟細胞，如巨核、紅、粒、單核細胞

1. 利用CellTrace Violet的方法去看了看具體的細胞分裂情況：

第1天基本上不分裂，但是從第3天開始，細胞已經(jīng)開始分裂了。

小結(jié)

整個fig3的話，其實是給我們模擬了臨床移植后的血細胞動態(tài)變化情況，并且根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象和我們想象的不太一致：移植后1天HSC不僅不增殖，反而就發(fā)生了分化！主要分化為了MPP細胞，從第三天才開始分裂。于是，當然去探索下到底為什么呀！

PART3-移植HSC動態(tài)分化成HSC和MPP

HSC

1. 這里就比較了下正常情況下的tHSCs和移植到小鼠體內(nèi)后收集GFP+的Tx tHSCs之間的差異：

這里需要注意點，我之前做分析的時候這了曾經(jīng)出過錯，因為我之前認為，既然他們按照轉(zhuǎn)錄組水平上聚類可以聚到一起，那么他們之間應(yīng)該是沒有區(qū)別的，但是后來在一個博后師姐的指導(dǎo)下發(fā)現(xiàn)，其實這里也會有差異，具體生信方面的處理可以去seurat官網(wǎng)看Stimulated vs Control PBMCs：

https:///seurat/v3.1/immune_alignment.html

回到文獻：

圖a：

• 與正常tHSCs相比，Tx tHSCs在干細胞信號上有明細下調(diào)

• 發(fā)現(xiàn)增殖水平上，移植的Tx tHSC1有下調(diào)，而移植的Tx tHSC2出現(xiàn)上調(diào)。結(jié)果和圖b中的cell cycle結(jié)果相一致：

• 移植的Tx tHSC1增殖的細胞減少

• 移植的Tx tHSC2增殖的細胞增多

1. 既然在增殖能力上有差異，是不是說分化潛能上也有差異呢？就在轉(zhuǎn)錄組水平看了看分化能力：

• 移植的Tx tHSC1向MK、紅系、髓系分化能力減低

• 移植的Tx tHSC2向MK、紅系分化能力增大

1. 這里先小結(jié)下上面的結(jié)論：

于是認為這里的：

• Tx tHSC1處于一種quiescent的靜息狀態(tài)

• Tx tHSC2則處于一種activated  的向下分化狀態(tài)，通過分化產(chǎn)生成熟有功能的血細胞來滿足機體對氧氣、免疫等功能的迫切需求。

MPP

1. 先看看tMPPs在移植后的數(shù)量變化趨勢：

• tMPP1移植初期迅速升高，持續(xù)不久，第3天>30%，但是第7天迅速<5%。

• tMPP2移植初期迅速升高，持續(xù)較久，第3天>30%，第5天>40%，但是第7天迅速<20%。

• tMPP3移植初期如同“后浪”，直到第5天都處于低水平，第7天突然>30%。

• tMPP4移植初期宛若一個長期投資，可能由于觀察時間太短，在觀察期內(nèi)一直處于一個較低水平。

• tMPP5移植初期變化幅度低，直到第5天才緩慢上升到20%。

1. 出現(xiàn)這種數(shù)量上的差異后，首先想到的問題當然是cell cycle上的問題咯，于是就看看這期間細胞周期的狀態(tài)：

• tMPP2、tMPP3和tMPP4的確還算是比較相符。

• tMPP5倒是有些奇怪了？？不過畢竟這是轉(zhuǎn)錄組水平上的分析，如果要“金指標”的話可能還是要功能驗證吧

1. 看完tMPPs在移植后的數(shù)量變化趨勢，接著看看與穩(wěn)態(tài)下tMPPs相比，移植后（Tx tMPPs）的功能（分化）變化趨勢，用的是GSEA分析，原圖在supplement太多，正文就用了下面的展示形式：

上面的結(jié)果簡單歸納后如下表：

看到這里不同的Tx tMPPs之前分化情況有所差異，那么就想看看TF的變化，于是就找到紅系（Phb2和Nfia）、MK（Pf4和Vwf）、髓系（Spi1和Cebpd）、淋系（Flt3和Satb1）的幾個特異TF，看他們的表達情況：

4. 接著整體比較了下穩(wěn)態(tài)下tMPPs和移植后（Tx tMPPs）的差異基因，用火山圖進行展示：

移植后的Tx tMPPs會：

• 上調(diào)應(yīng)激相關(guān)基因，如：Ifitm3，S100a6，Serpina3g

• 下調(diào)B系分化相關(guān)基因，如：Ramp1，Cd52，Pnp

1. 后面看了幾個表面marker的變化——CD201、CD150和CD48：

結(jié)合上面的數(shù)據(jù)，認為紅髓系分化維持平衡，而淋系分化受到抑制。

小思考

看到這里我想到一個問題，為什么Tx tMPPs數(shù)目會減少呢？我覺得原因有下面3個：

• 它的轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)生了改變，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄組水平上我們以為它變化了，可能實際上它只是狀態(tài)發(fā)生改變（就像Tx tMPP2在第5天迅速下降，而Tx tMPP3則在同時迅速上升，是不是他們發(fā)生了轉(zhuǎn)化呢？？）

• 這些細胞發(fā)生了向下游分化，而不再是MPP（如果是這樣，那么我們應(yīng)該可以看到下游細胞數(shù)目增多，但是從fig3 fgh來看，下游的祖細胞并沒有增加，但是奇怪的是第7天成熟細胞卻一下增多了，難不成直接從MPP跳到了成熟細胞？？）

• 這些細胞發(fā)生了凋亡（這個好像沒看到數(shù)據(jù)）

PART4-功能驗證

使用單細胞克隆形成實驗和二次移植實驗來驗證移植后HSPCs數(shù)目和分化能力的改變。

1. 因為我也沒有做過這種實驗（老實說，我就沒怎么做過細胞和小鼠實驗，我主要在測序），幸好methods里講的還算詳細，也就大致理解了意思吧，這里是收集正常穩(wěn)態(tài)下ESLAMSK細胞，然后收集移植后，1，3，5，7天時的GFP+全部細胞在培養(yǎng)基上種植：

• ab圖：克隆形成的效率。看來移植后的HSPCs整體功能上都發(fā)生了衰退。

• c圖：E-紅系；n-中性粒；m-巨噬；M-巨核；可以看到圖中用黑色標記出來的部分，說明第1、3天時多系分化的比例還是正常的。5、7天時則有所下降了。同樣，在二次移植實驗中，D1的GFP+細胞展現(xiàn)了類似的結(jié)果。

1. 二次移植結(jié)果顯示重建和植入能力是逐漸下降的：

因為還是沒有做過實驗，所以這類圖看起來真的是有點費力了，想要看懂這個圖，首先我們要知道這個實驗——二次移植實驗是怎么做的：

首先從接受移植的小鼠骨髓/脾臟中拿到一定數(shù)目的GFP+細胞（一次移植的產(chǎn)物），因為得到的細胞數(shù)比較少，所以和3*10⁵全骨髓細胞一起混合后，移植到另外一只受體小鼠中（二次移植），再在特定時間點1、3、4個月的時候行檢測GFP+細胞。一般檢測移植重建都是看外周血T，B，M 情況。真正的LT -HSC 是可以實現(xiàn)外周血重建比例逐漸升高，同時T、B、M各系都有。理解了做法，下面來看一下結(jié)果：

骨髓來源：第1天的GFP+細胞重建效率還好，但是第3、5、7天的GFP+細胞重建效率則大大降低

脾臟來源：同骨髓來源的數(shù)據(jù)一致。不過在D3的移植后3個月有個高峰，說明細胞后來發(fā)力了？？數(shù)據(jù)比較少，不太好下結(jié)論。

上述數(shù)據(jù)說明了移植后≥3天受者體內(nèi)HSC減低。而在移植后1天受者體內(nèi)功能上還是很像LT-HSC的，因為D1細胞可以實現(xiàn)外周血重建比例逐漸升高，同時T、B、M各系都有。

這里需要注意的是，我們注射的是GFP+細胞，根據(jù)前面的數(shù)據(jù)提示，注射的GFP+細胞中絕大部分是tMPPs了（fig 3所示）。

3. 想要進一步確定第一次移植后收集的細胞中持久、長期重組的細胞來源，于是使用了報道的PVA培養(yǎng)體系，然后培養(yǎng)48h后的細胞拿去做scRNA-seq，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組水平定義來判斷細胞的組成：

藍色字表示拿去做scRNA-seq的細胞數(shù)?？梢郧逦吹?，在移植后哪怕第1天，很多tHSCs都發(fā)生了分化，而且從轉(zhuǎn)錄組水平來看，增加的主要是tMPPs。說明了什么呢：

• 移植到體內(nèi)后，從轉(zhuǎn)錄組水平來看，細胞是會立馬開始分化的。

至于PVA培養(yǎng)體系的話，從D1、D3的數(shù)據(jù)來看好像是并沒有發(fā)生分化，但是Fresh的數(shù)據(jù)看出還是發(fā)生了分化的！

4. 接著又做了LDA實驗：

• 看來隨著移植時間的延長，LT-HSC的數(shù)量還是在下降，尤其是在第5天可能是個拐點吧！

小結(jié)

上述體外細胞培養(yǎng)實驗和體內(nèi)移植實驗都說明，移植到受者后，早期HSC細胞數(shù)量和功能還可以維持，后期會迅速降低。

PART5-移植的HSC分化出紅、髓系前體細胞

1. 這里主要對一個比較有趣的現(xiàn)象進行探討，在fig3中，已經(jīng)成熟分化的細胞在第一天出現(xiàn)>30%，而在第3、5天迅速降低到<1%，而到第7天又升高到20%：

其中如果細看具體的成熟分化細胞：

當然，上面的都是轉(zhuǎn)錄組水平，那么用marker從免疫表型上來看呢：

這里文章只show了第1和7天的數(shù)據(jù)，不知道為什么沒有展示下第3、5天的數(shù)據(jù)???♂?

2. 不過基于上述數(shù)據(jù)，加上一些基礎(chǔ)的血液學(xué)知識，我們知道之前有文章報道從HSC到紅、髓系細胞之間是存在一個近道通路（bypass）的：

推薦看一篇綜述，之前推文里也介紹過的：

Cheng H, Zheng Z, Cheng T. New paradigms on hematopoietic stem cell differentiation[J]. Protein & cell, 2019: 1-11.

下載地址：https://link./content/pdf/10.1007/s13238-019-0633-0.pdf

關(guān)于目前HSPCs的分化軌跡，這篇綜述寫的還是挺好的，看完可以收獲很多。

3. 于是就推測：在移植后第1天就出現(xiàn)了這種從HSC直接紅、髓系細胞的近道通路（bypass），通過這種機制來滿足機體對于紅、髓系細胞的迫切需求。為了驗證，就對移植后特點時間點下的供者來源細胞進行了qRT-PCR：

移植后第1天，與受者體內(nèi)的Ter119+細胞相比：

供者來源的Ter119+細胞，并不是成熟細胞，而是表達干細胞相關(guān)基因（Kit，Slamf1，F(xiàn)gd5和Gata2），巨核相關(guān)基因（Pf4，Selp）以及紅系相關(guān)基因（Lmo2和Tal1）。

移植后第1天，與受者體內(nèi)的Mac-1+Gr-1+細胞相比：

供者來源的Mac-1+Gr-1+細胞表達髓系相關(guān)基因（Csf1r、Csf2rb和Csf3r）

通過比較tMEs在D1和D7之間的差異：免疫相關(guān)基因在D1高表達（圖中最底部），D7時主要高表達的是一些蛋白模定位相關(guān)的基因（不是很了解這方面，和信號肽可能相關(guān)）。

4. 最后分析比較了穩(wěn)態(tài)下和移植后外周血清中EPO和G-CSF的表達水平：

• 可以看到，移植后血清中EPO和G-CSF的水平明顯升高，這兩個細胞因子都和HSC下游分化密切相關(guān)。

1. 最后，為了說明移植后向紅系和髓系分化，又比較了穩(wěn)態(tài)和移植后Ifitm1在tMPP2，tMPP3，tCP1，tME1和tGM1中的變化：

以上數(shù)據(jù)共同說明了：

移植后，早期HSC/MPP會向分化紅系和髓系分化，甚至出現(xiàn)成熟細胞的表面marker，但這些看似分化的細胞仍然保留著一些不成熟的特征。

討論

這里通過一幅示意圖總結(jié)下整個文章的結(jié)論：

• 和穩(wěn)態(tài)下的HSC相比，移植后的HSC會更多分化為MPP，在早期主要向著紅巨和髓系分化。

• 移植后的HSC自我更新能力受限，而在早期迅速開始分化。

疑問

下面是我最開始讀的時候產(chǎn)生的一些問題，很多都直接在正文中回答了，但是還是放在這里吧，說不定日后會有更多的想法？？

1. 正常來說，血細胞的細胞周期狀態(tài)是怎么樣的？我只知道干細胞大多是處于G0，但是下游祖細胞，甚至是成熟細胞的話，他們能分裂嗎？

2. 做移植為什么用ESLAMSK細胞？為什么不用Fraction Ⅰ？

3. 利用前面的圖譜，將這次測序的數(shù)據(jù)和圖譜進行KNN算法的映射對應(yīng)。用的什么時候的樣本細胞？？？Homeostasis？？？

后記

        其實整個工作還是挺漂亮的，也有很多看問題不錯的角度和思路，看完后還是學(xué)到了很多東西的。一定程度上也讓我了解到了移植后HSC的變化趨勢，非常的神奇，和我們想象中的并不一樣！而且，在文章最后提到的現(xiàn)象——具有分化細胞的表型，但是在轉(zhuǎn)錄組水平上卻仍保留有干細胞相關(guān)基因的表達，也是非常有趣了。