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本期，我們講講全基因組DNA甲基化實(shí)驗(yàn)怎么做，從技術(shù)原理、建庫測序流程、信息分析流程和研究套路等四方面詳細(xì)介紹。

一、全基因組甲基化測序技術(shù)原理

表觀修飾不需要改變 DNA 序列便能實(shí)現(xiàn)對性狀的改變，表觀修飾的改變與基因功能乃至細(xì)胞狀態(tài)、發(fā)育、衰老、疾病等存在重要的關(guān)聯(lián)。在眾多的表觀遺傳修飾中，最為重要且研究最為廣泛的修飾之一是 DNA 甲基化，而全基因組甲基化測序（WGBS-seq）無疑是最有效的研究手段。

全基因組甲基化測序利用重亞硫酸鹽能夠?qū)⑽醇谆陌奏ぃ–）轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶 （T）的特性，將基因組用重亞硫酸鹽處理后測序，即可根據(jù)單個(gè) C 位點(diǎn)上未轉(zhuǎn)化為 C 未轉(zhuǎn)化為 T 的 reads 數(shù)目與所有覆蓋的 reads 數(shù)目的比例，計(jì)算得到甲基化率。該技術(shù)對于全面研究胚胎發(fā)育、衰老機(jī)制、疾病發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳機(jī)制，以及篩選疾病相關(guān)的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記位點(diǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

全基因組甲基化測序原理示意圖入下：

圖1：重亞硫酸鹽測序技術(shù)原理

二、全基因組甲基化測序建庫流程

樣品檢測——樣品打斷 ——文庫構(gòu)建——BS處理——文庫質(zhì)檢

（一）樣品檢測

對DNA樣品的檢測主要包括2種方法：

（1）瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有污染，檢測具有明顯的主帶，且條帶清晰；

1. Qubit 2.0對DNA濃度進(jìn)行精確定量，DNA檢測總量不低于1ug。

（二）文庫構(gòu)建

樣本檢測合格后，使用Bioruptor系統(tǒng)將1μg樣品基因組DNA與未甲基化的lambda DNA混合，然后將其片段化，平均大小約為250bp。片段化后，純化的隨機(jī)片段化DNA隨后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物進(jìn)行修復(fù)，鈍化和磷酸化末端。隨后使用Klenow片段（3'-5'exo-）對鈍的DNA片段進(jìn)行3'腺苷酸化，然后與連接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA連接酶的胞嘧啶連接的銜接子進(jìn)行連接。完成每個(gè)步驟后，使用磁珠純化DNA。之后，根據(jù)說明使用ZYMO EZ DNA甲基化金試劑盒將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再使用磁珠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化獲得最終文庫。

（三）文庫質(zhì)檢

文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1ng/ul，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度> 2nM），以保證文庫質(zhì)量。

（四）上機(jī)測序

文庫檢測合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后在illumina Nova平臺(tái)測序，測序策略為PE150。

三、全基因組甲基化測序信息分析流程

（一）原始下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控

原始下機(jī)數(shù)據(jù)為FASTQ格式，是高通量測序的標(biāo)準(zhǔn)格式。FASTQ文件每四行為一個(gè)單位，包含一條測序序列（read）的信息。該單位第一行為read的ID，一般以@符號(hào)開頭；第二行為測序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一個(gè)+號(hào)，或者與第一行的信息相同；第四行是堿基質(zhì)量值，是對第二行序列的堿基的準(zhǔn)確性的描述，一個(gè)堿基會(huì)對應(yīng)一個(gè)堿基質(zhì)量值，所以這一行和第二行的長度相同。以下為一條read信息的示例：

原始下機(jī)數(shù)據(jù)包含建庫時(shí)引進(jìn)的接頭序列以及質(zhì)量過低的堿基，這些因素會(huì)導(dǎo)致后續(xù)比對到基因組的reads較少，從而導(dǎo)致得到的信息較少，因此需要進(jìn)行過濾。利用trim_galore軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭序列及低質(zhì)量堿基等質(zhì)控步驟。

（二）序列比對

經(jīng)過質(zhì)控的reads需要根據(jù)與參考基因組的序列相似度比對到參考基因組上。相比于常規(guī)基因組及轉(zhuǎn)錄組測序，WGBS測序方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的特點(diǎn)決定其在比對時(shí)存在三大困難：

（1）DNA片段正鏈和負(fù)鏈經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后將不再反向互補(bǔ)，再經(jīng)過PCR，便會(huì)產(chǎn)生四條不同的序列，這將大大增加比對時(shí)的計(jì)算量。

（2）經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，DNA序列大部分C堿基被轉(zhuǎn)化成T堿基，因此序列含大量T而缺乏C；經(jīng)過PCR后，產(chǎn)生的互補(bǔ)鏈則含有大量A而缺乏G。這樣便導(dǎo)致序列的復(fù)雜度降低（即序列的組成特征更單一），從而增加比對的難度。

（3）C和T的比對是不對稱的。經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，序列中非甲基化的C堿基（占大部分）被轉(zhuǎn)化為T，這將導(dǎo)致測序序列與參考基因組不匹配，T既可能應(yīng)該比對到T上，有可能應(yīng)該比對到C上；而C則只能比對到C上。這也增加了比對的難度。

利用BSMAP軟件進(jìn)行比對。BSMAP進(jìn)行比對時(shí)，先以參考基因組上C堿基的位置作為指導(dǎo)，將reads中對應(yīng)參考基因組C堿基位置的T標(biāo)記為C，其他T保持不變，從而使reads可以直接比對到參考基因組。

（三）甲基化水平計(jì)算

甲基化水平可根據(jù)未轉(zhuǎn)化為 T 的 C 與轉(zhuǎn)化為 T 的 C 的 reads 的比例計(jì)算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中，Beta-value 即為該胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 為覆蓋該位點(diǎn)的支持甲基化的reads 數(shù)目（測得該位點(diǎn)為 C 的 reads），T-reads 為覆蓋該位點(diǎn)的不支持甲基化的 reads 數(shù)目（測得該位點(diǎn)為 T 的 reads）。 計(jì)算原理示意圖如下：

利用BSMAP統(tǒng)計(jì)甲基化水平。

（四）差異甲基化區(qū)域（DMR）鑒定及統(tǒng)計(jì)

DMR檢測使用權(quán)威期刊發(fā)表的metilene軟件。該軟件先將基因組進(jìn)行預(yù)分段，以排除較長序列中不包含CG位點(diǎn)的片段。隨后，利用二元分隔算法，遞歸縮小檢測范圍，以搜索得到組間累積平均甲基化差異最大的區(qū)域，作為可能的DMR；最后，結(jié)合雙重統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)（MWU-test和2D KS-test），得到準(zhǔn)確的DMR。檢測原理如下圖所示：

本分析檢測DMR的標(biāo)準(zhǔn)如下：

（1）區(qū)域平均甲基化差異不小于0.1；

（2）CpG位點(diǎn)數(shù)不少于5個(gè)；

（3）區(qū)域長度不小于50 bp；

（4）甲基化水平差異統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的校正P值小于0.05；

（5）2D KS-test檢驗(yàn)P值小于0.05。

（五）信息分析流程示意圖

四、總結(jié)：全基因組甲基化研究思路

DNA甲基化組學(xué)研究的核心內(nèi)容在于對DNA甲基化數(shù)據(jù)的挖掘。DNA甲基化一般遵循三個(gè)步驟進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。

1. 首先，進(jìn)行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關(guān)性分析等。

2. 其次，進(jìn)行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結(jié)合分析、時(shí)序甲基化數(shù)據(jù)的分析策略、DMG的功能分析等。

3. 最后，將甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，包括Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對應(yīng)關(guān)聯(lián)、網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)等。

五、全基因組甲基化研究案例

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 兩種狀態(tài)的小鼠胚胎干細(xì)胞的甲基化組學(xué)研究

1、背景

小鼠胚胎干細(xì)胞一般生長在含有血清的基質(zhì)中，被稱作血清干細(xì)胞(serum ESCs)；加兩種激酶抑制因子使胚胎干細(xì)胞在無血清的情況下更能保持多能性的基態(tài)，這種干細(xì)胞稱為2i干細(xì)胞(2i ESCs)；這兩種狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞可以互相轉(zhuǎn)化。以前這方面的甲基化研究大多基于質(zhì)譜，覆蓋度和研究結(jié)果有限，尚缺乏2i胚胎干細(xì)胞的甲基化組學(xué)研究。

2、方法

利用全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS），對這兩種可互相轉(zhuǎn)換的小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行甲基化組學(xué)研究

3、結(jié)論

全面準(zhǔn)確的檢測了兩種小鼠胚胎干細(xì)胞的DNA甲基化修飾并進(jìn)行了系統(tǒng)的比較；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs類似呈現(xiàn)全局低甲基化，而在2i ESCs狀態(tài)下，甲基化水平會(huì)進(jìn)一步降低。

以上就是關(guān)于全基因組甲基化測序?qū)嶒?yàn)流程和分析思路的介紹，易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情了解請致電易基因0755-28317900。

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