未經(jīng)治療的狂犬病感染幾乎100%致死，每年導(dǎo)致50000至60000人死亡，其中很多是兒童。人用狂犬病疫苗由滅活病毒組成，僅在短期內(nèi)（接種疫苗6個月至一年）具有完全保護(hù)作用，無法引發(fā)終身免疫。在人體中，疫苗引發(fā)的中和抗體水平通常在接種疫苗后1至5年下降，所以需要頻繁接種疫苗以維持中和抗體滴度，提供對狂犬病感染的保護(hù)。而在大多數(shù)狂犬病死亡發(fā)生率較高的低收入國家，很難負(fù)擔(dān)得起經(jīng)常接種疫苗以及接觸病毒后的治療。因此，長效狂犬病疫苗的研發(fā)很關(guān)鍵。

狂犬病毒糖蛋白(RABV-G)是病毒表面暴露的唯一蛋白質(zhì)，是疫苗誘導(dǎo)的中和抗體的靶點(diǎn)。在病毒表面，RABV-G的結(jié)構(gòu)是異質(zhì)的，只有一部分是可識別的三聚體。而結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性可能會影響針對第四表位的中和抗體的產(chǎn)生，并可能導(dǎo)致接種后免疫應(yīng)答的時間較短。

在最近的一項研究中，來自美國拉霍亞免疫學(xué)研究所和法國巴斯德研究所領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊報道了與人抗體RVA122結(jié)合的三聚體野生型RABV-G的結(jié)構(gòu)，可用于指導(dǎo)改進(jìn)疫苗的設(shè)計和確定治療藥物靶點(diǎn)。相關(guān)研究成果以“Structure of the rabies virus glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody”為題，發(fā)表在Science Advances上。

圖1 研究成果（圖源：[1]）

科學(xué)家無法準(zhǔn)確地回答為什么狂犬病疫苗不能提供長期保護(hù)，但RABV-G結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性確實(shí)是一個關(guān)鍵性問題。就像瑞士軍刀一樣，RABV-G的序列可以在需要時展開并向上翻轉(zhuǎn)。糖蛋白可以在融合前（與宿主細(xì)胞融合之前）和融合后形式之間來回移動，它也可能分崩離析，從三聚體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w結(jié)構(gòu)。

這種變形方式彷佛為狂犬病病毒提供了一種隱形斗篷，因為人類抗體通常只能識別蛋白質(zhì)上的某個單一位點(diǎn)，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)隱藏或移動這些蛋白質(zhì)位點(diǎn)時，抗體就無法準(zhǔn)確識別，自然也就無法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

在這項研究中，研究人員將糖蛋白RABV-G與單克隆抗體RVA122結(jié)合，以確定病毒結(jié)構(gòu)中容易受到抗體攻擊的位點(diǎn)。RVA122是狂犬病免疫所需的抗體類型，可以有效地中和狂犬病病毒。與RVA122的結(jié)合使通過冷凍電子顯微鏡可見的RABV-G三聚體的比例增加了30倍以上，使高分辨率重建成為可能，并將RABV-G鎖定在融合前構(gòu)象中，這是因為RVA122可能通過抑制RABV-G向融合后構(gòu)象的轉(zhuǎn)變來中和狂犬病病毒。

圖2 與中和抗體RVA122結(jié)合的融合前RABV-G三聚體的結(jié)構(gòu)（圖源：[1]）

圖3 RVA122（綠色）與RABV-G（深藍(lán)色和淺藍(lán)色）之間的相互作用（圖源：[1]）

通過冷凍電子顯微鏡設(shè)備，研究人員捕獲到了RABV-G的高分辨結(jié)構(gòu)圖像，這一結(jié)構(gòu)凸顯了病毒結(jié)構(gòu)的兩個關(guān)鍵部分——融合肽在自然狀態(tài)下的形態(tài)。當(dāng)RABV-G三聚體沒有錨定在膠束或細(xì)胞膜上時，融合肽要么是無序的，要么是相互作用的。這些結(jié)果表明，除了在內(nèi)體酸化后驅(qū)動病毒和細(xì)胞膜的融合之外，融合肽還影響糖蛋白胞外域結(jié)合和三聚化。

為了確定融合肽是否也影響全長RABV-G的構(gòu)象和穩(wěn)定性，研究人員將融合肽點(diǎn)突變體表達(dá)為全長糖蛋白，包括跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾，并用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光對其進(jìn)行分析染色。RABV-G突變體的所有全長版本都很好地表達(dá)并且容易到達(dá)細(xì)胞表面，但含有W121A的突變體，融合前構(gòu)象中的全長蛋白明顯減少。這一結(jié)果表明，對于全長糖蛋白，W121通過與膜相互作用來穩(wěn)定融合前構(gòu)象，防止糖蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)樘娲鷺?gòu)象。W121和病毒膜之間的相互作用也可能使RABV-G穩(wěn)定在病毒粒子表面。

RABV-G是疫苗的重要組成部分，也是抗體治療和潛在抗病毒藥物的靶標(biāo)，但其存在的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性可能導(dǎo)致次優(yōu)抗體反應(yīng)。融合前的三聚體RABV-G將是一種理想的疫苗免疫原，但由于該分子的不穩(wěn)定性，這種形式的呈現(xiàn)存在一定挑戰(zhàn)性。而該項研究報告了融合前三聚體RABV-G的結(jié)構(gòu)，證明了融合肽對成功三聚化和構(gòu)象穩(wěn)定的重要性，還可視化了有效和廣泛中和抗體表位，這些將共同指導(dǎo)、改進(jìn)狂犬病疫苗的研發(fā)以及暴露后的治療。

通過該項研究，科學(xué)家們對狂犬病病毒結(jié)構(gòu)有了更加清晰的認(rèn)識，也為長效狂犬疫苗的設(shè)計研發(fā)打開了大門，甚至可以預(yù)防整個狂犬病病毒屬。根據(jù)研究人員所說，下一步工作是捕獲更多狂犬病病毒及其親屬病毒的圖像以及中和抗體，科學(xué)家們正在努力發(fā)現(xiàn)其中幾個病毒結(jié)構(gòu)，這可能會揭示狂犬病病毒共有的抗體靶點(diǎn)。

該項研究的第一作者表示：“狂犬病是我們所知道的最致命病毒之一，千年以來，我們一直生活在它的陰影之下。然而，科學(xué)家們卻從未觀察到它表面的分子結(jié)構(gòu)。了解這種結(jié)構(gòu)，就像了解病毒如何進(jìn)入宿主細(xì)胞一樣，對于開發(fā)更有效的疫苗和治療方法至關(guān)重要”。