2021年，諾獎(jiǎng)得主、斯坦福大學(xué) Carolyn Bertozzi 教授團(tuán)隊(duì)和哈佛大學(xué) Ryan Flynn 教授首次發(fā)現(xiàn)了一種被聚糖（glycan）修飾的RNA分子，名為糖基化RNA（glycoRNA）。這種分子由修飾了含有唾液酸的聚糖的小RNA構(gòu)成，能夠與唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素（siglec）進(jìn)行相互作用，顯示出其可能的重要生理功能。

然而，迄今為止，由于缺乏有效且特異性的成像技術(shù)，對(duì)糖基化RNA的研究受到了限制，我們對(duì)這種分子的了解仍然非常有限，例如其在細(xì)胞內(nèi)的分布、生理作用以及與疾病的關(guān)聯(lián)仍尚未明確。

2023年5月22日，德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校陸藝教授團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology期刊發(fā)表了題為：Spatial imaging of glycoRNA in single cells with ARPLA 的研究論文。

該研究開(kāi)發(fā)了一種名為ARPLA（唾液酸適配體和RNA原位雜交介導(dǎo)的鄰位連接技術(shù)）的糖基化RNA原位成像方法。該方法首次實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)直接原位觀測(cè)糖基化RNA，并具有極高的靈敏度和特異性。ARPLA可用于觀察細(xì)胞中的糖基化RNA，揭示其在細(xì)胞內(nèi)的分布，并能靈敏捕捉到其在疾病和生理過(guò)程中的變化情況。

陸藝教授課題組利用鄰位連接技術(shù)（proximity ligation assay）開(kāi)發(fā)糖基化RNA原位成像技術(shù)ARPLA（圖1）。該方法通過(guò)核酸適配體（aptamer）、原位雜交技術(shù)（in situ hybridization）實(shí)現(xiàn)對(duì)糖基化RNA的聚糖和RNA部分的雙重識(shí)別，然后利用DNA鄰位連接技術(shù)，生成完整的環(huán)狀DNA，作為滾環(huán)擴(kuò)增的模板，產(chǎn)生長(zhǎng)序列單鏈DNA。然后，該DNA產(chǎn)物通過(guò)互補(bǔ)的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針DNA雜交，用于提供糖基化RNA的位置和豐度信息。該方法首次實(shí)現(xiàn)了高靈敏性的糖基化RNA成像，具有較高的選擇性和特異性，是研究糖基化RNA在不同細(xì)胞類(lèi)型中的空間分布和相對(duì)豐度的有力工具。

圖1. ARPLA技術(shù)路線及工作原理

通過(guò)ARPLA，研究人員首次在亞細(xì)胞水平上觀察到了糖基化RNA的分布。脂筏（lipid rafts）是許多信號(hào)受體錨定的關(guān)鍵細(xì)胞膜微域，研究人員發(fā)現(xiàn)糖基化RNA主要分布在細(xì)胞膜上，并與脂筏共定位（圖2）。幾十年來(lái)，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)上的聚糖對(duì)于細(xì)胞和細(xì)胞病原體之間的交流至關(guān)重要。ARPLA為探索糖基化RNA與脂質(zhì)筏錨定受體之間的相互作用提供了有價(jià)值的線索。與此同時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)，糖基化RNA定位于SNARE蛋白包裹的脂質(zhì)囊泡中，表明糖基化RNA內(nèi)的運(yùn)輸途徑是通過(guò)SNARE介導(dǎo)的膜融合和胞外作用。 

圖2. 糖基化RNA與脂伐共定位

為了探索糖基化RNA與疾病的潛在關(guān)聯(lián)，研究人員探究了健康乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中糖基化RNA豐度的差異。此前，科學(xué)家們?cè)诙喾N癌癥類(lèi)型中發(fā)現(xiàn)了唾液酸高表達(dá)現(xiàn)象。然而，此次研究中發(fā)現(xiàn)糖基化RNA呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。在健康細(xì)胞中，研究人員發(fā)現(xiàn)糖基化RNA的豐度最高，而隨著癌癥的進(jìn)展、遷移，糖基化RNA的豐度會(huì)顯著下降。這一發(fā)現(xiàn)表明糖基化RNA具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)途徑，這與糖蛋白和糖脂的規(guī)律有所區(qū)別，進(jìn)一步揭示了糖基化RNA在維持身體健康狀態(tài)中的獨(dú)特作用。

圖3. 糖基化RNA在癌癥進(jìn)展過(guò)程中豐度下降

在另一個(gè)重要的生物學(xué)模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞的發(fā)育成熟會(huì)導(dǎo)致表明糖基化RNA水平的降低。引人注目的是，一旦細(xì)胞受到細(xì)菌抗原脂多糖（LPS）的刺激，糖基化RNA水平會(huì)顯著增加。這表明在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，糖基化RNA在抗細(xì)菌侵染免疫反應(yīng)中扮演著重要角色。這些重要的發(fā)現(xiàn)凸顯了ARPLA在揭示糖基化RNA的生理性質(zhì)極其重要生物學(xué)作用方面的強(qiáng)大實(shí)用性。 

ARPLA是首次實(shí)現(xiàn)了糖基化RNA的細(xì)胞內(nèi)原位成像，并具有高靈敏性和高特異性。它無(wú)需代謝標(biāo)記預(yù)處理，ARPLA可以實(shí)現(xiàn)在各種類(lèi)型的樣品中用于觀測(cè)天然未標(biāo)記的糖基化RNA。此外，該方法可以通過(guò)簡(jiǎn)單地改變ARPLA探針的RNA識(shí)別序列來(lái)實(shí)現(xiàn)幾乎任何糖基化RNA的成像。 

未來(lái)，研究人員可以進(jìn)一步優(yōu)化ARPLA以產(chǎn)生更高的信號(hào)強(qiáng)度和分辨率，并設(shè)計(jì)用于檢測(cè)活細(xì)胞中的糖基化RNA。在不久的將來(lái)，ARPLA可以成為研究糖基化RNA在各種生物系統(tǒng)中的作用的寶貴工具。 

德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的馬媛博士、郭偉杰為論文共同第一作者，陸藝教授為通訊作者。這項(xiàng)研究得到了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、Susan G. Komen基金會(huì)和Robert A. Welch基金會(huì)的支持。