慢病毒載體（LV）提供了許多有價值的特性，包括穩(wěn)定的將基因整合到宿主基因組中，通過VSV-G假型分型將遺傳信息轉移到分裂和非分裂細胞以及廣泛的組織趨向性能力。目前正在臨床試驗中用于治療罕見和更頻密的遺傳和后天疾病，以及CAR-T細胞癌癥治療。

慢病毒載體通常是通過多質粒瞬時轉染HEK 293貼壁細胞株而產生，此細胞株通常培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)液中。然而這種方法是實驗室密集型，需依賴質粒的供應，不能直接放大。貼壁培養(yǎng)需通過增加細胞附著和生長的可用面積來放大。由于瞬時轉染中過量的質粒和轉染試劑的殘留，會引起終產物的污染。因此，穩(wěn)定的慢病毒載體生產細胞株運行而生。目前已成功的構建方法是通過誘導系統(tǒng)來避免細胞毒素蛋白（Gag，Rev和VSV-G）的持續(xù)表達而引起的細胞凋亡。用于穩(wěn)定生產的貼壁細胞株已被廣泛報道，但卻限制了放大和大規(guī)模生產。通過高度強化的貼壁培養(yǎng)物，及一次性固定床生物反應器，已解決部分病毒放大培養(yǎng)。與此同時，一些學術和工業(yè)實驗室正在開發(fā)懸浮培養(yǎng)工藝，最終可實現(xiàn)在傳統(tǒng)的攪拌罐中完成慢病毒載體的生產。

根據(jù)近期文獻報道，該領域正在向應用懸浮工藝生產慢病毒載體的方向發(fā)展。事實上，在治療中應用的慢病毒載體，需要以可再生的方式生產足夠數(shù)量的臨床和商業(yè)品質的病毒。根據(jù)應用和疾病，每名患者需要1-40 × 10 ⁹個感染單位的載體; 不僅增加了經濟壓力，還需要開發(fā)高產量的生產工藝。

在本研究中，我們提出了一種生產慢病毒載體的方案，它使用的是一種穩(wěn)定的可誘導的生產細胞系，并且該細胞系為我們之前描述的并且在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的包裝細胞系。在添加cumate和多西環(huán)素后，可誘導包裝慢病毒載體所必需組件的基因表達。由于慢病毒載體的穩(wěn)定性差，我們開發(fā)了一種在灌流模式下的生產工藝，并評估了兩種方案的差異。

本研究所述的實驗中，HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92細胞系（簡稱clone 92）生長和維持在SFM4TransFx293 (Hyclone)或者iHyCell? TransFx-H media (Hyclone)培養(yǎng)液中，并且兩種培養(yǎng)液均添加4mM L-谷氨酰胺。泊洛沙姆188是一種適用于高剪切力環(huán)境中的保護劑，并且在HyCell? TransFx-H培養(yǎng)液中添加0.1%泊洛沙姆188。Cell Boost 5?（CB5）補充劑（3.5 g / L）（Hyclone）是一種化學成分的增強劑，只有在文中注明的情況下才補充。使用軌道搖床(InforsHT)，設置110-120 rpm，37℃，5%CO₂條件下于搖瓶中懸浮培養(yǎng)。通過自動細胞計數(shù)器（Cedex Automated Cell Counter或Nucleocounter?nc-200?）或血球計數(shù)板和赤蘚紅B進行細胞計數(shù)。當細胞密度達到2×10 ⁶個/ mL時，進行規(guī)律傳代。

根據(jù)制造商建議，使用maxiprep試劑盒(Chiagen)純化質粒。先前已經闡述通過一步法獲得構建HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92所使用的包裝細胞系（即，所有LV組分在一次轉染中同時加入）¹⁴。為了構建clone 92，使用Lipofectamine 2000試劑（Life Technologies）與經StuI 線性化的pCSII-CMV5-GFP質粒和經Xho1線性化的編碼殺稻瘟菌素的抗性的pCDNA6-hisA (Life Technologies) 質粒共同轉染在補充有1％FBS（Hyclone）的LC-SFM培養(yǎng)液（Life Technologies）中培養(yǎng)的包裝細胞系（clone 29-6），上述兩種質粒質量比（μg/μg）為7：1。轉染兩天后，向培養(yǎng)液中加入7μg/ mL殺稻瘟菌素（InvivoGen），直至產生具有抗殺稻瘟菌素細胞庫（約三周）。然后使用不含有殺稻瘟菌素的培養(yǎng)液在96孔板中有限稀釋，并進行亞克隆。篩選克隆細胞并首次分析GFP的表達。將具有高水平GFP表達的克隆株擴增并通過加入1μg/ mL多西環(huán)素和30μg/ mL的cumate誘導細胞觀測慢病毒的產生。從最穩(wěn)定的生產克隆株中選取一株（clone 92），并在補充有4mM谷氨酰胺的SFM4Transfx-293無血清培養(yǎng)基（Hyclone）中適應性培養(yǎng)。研究細胞庫在補充有10％DMSO（Sigma）的相同培養(yǎng)基中制備。

將clone 92在SFM4TransFx-293中解凍，并接種在含有20mL培養(yǎng)液的125mL搖瓶中。在解凍后2、6、10周時，在1×10⁶個/mL細胞密度下誘導產生慢病毒載體。在48后，經離心澄清，收集含有慢病毒載體的上清液，并添加1%胎牛血清（保護劑），然后凍存在-80℃。采用基因轉移法測定上清液中慢病毒載體滴度（2.6節(jié)）。

在第一組搖瓶實驗中，細胞按0.2 x 10⁶個/mL接種在SFM4TransFx293培養(yǎng)液中。當細胞密度達到1.5 x 10⁶個/mL時，按照每瓶50mL分裝于250mL搖瓶中。誘導前，需每天更換培養(yǎng)液，即細胞經離心（300g，5mins）后，更換不同比例（1-100%）的新鮮培養(yǎng)液進行重懸，且連續(xù)換液5天。為了減少細胞聚集，細胞經Accumax TM（Sigma）處理30分鐘后，用Cedex自動細胞計數(shù)器進行細胞總數(shù)及活力的測定。

在第二組實驗中，細胞按0.3×10⁶個/mL密度分批次接種于500mL搖瓶中，培養(yǎng)液為100mL含有有3.5g/L CB5的HyCell? TransFx-H完全培養(yǎng)液。當細胞密度到達≥5E6 個/mL時，將細胞懸液按每瓶20mL分裝于125mL搖瓶中，并添加1μg/mL多西環(huán)素和30μg/ mL的cumate進行誘導。從誘導后24小時開始，每隔24小時，分別使用含有3.5 g/L CB5和不含CB5的的培養(yǎng)液進行50％換液。收集液經0.45μm過濾后，使用GTA測定病毒載體滴度。使用NucleoCounter?NC-200?記錄每日細胞總數(shù)和活力。

使用生物反應器進行4次分批實驗，同時灌流實驗1#與先前實驗條件相同；并且已經詳細描述過相似情況。即使用Chemap 3.5L型SG生物反應器容器（工作體積2.7L）并配備探針以測量和控制實驗參數(shù)（溫度37℃，pH 7.05-7.1，溶解氧（DO）40％，攪拌80rpm）。在灌流模式中，通過反吹模式的10L超聲濾器（AppliSens，Schiedam，Netherlands）將細胞保留在生物反應器中（每次反沖洗時將細胞懸浮液完全循環(huán)到生物反應器中），時間間隔為30分鐘，運行/停止比例為55/5秒（圖4）。培養(yǎng)物以分批模式培養(yǎng)至約1-1.5×10⁶個/ mL。灌流模式以每天0.5反應體積實施灌流（VVD），并在誘導后增加至1VVD。當灌流模式中到達目標細胞密度（5×10⁶個/mL）后進行誘導培養(yǎng)。

在灌流實驗2-4#中，將細胞以0.25-0.35x10⁶個/ mL的細胞密度接種到1L含有3.5g / L CB5的完全HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液（Hyclone）中，并在320F 1L攪拌罐反應器中批次培養(yǎng)（37℃，pH7.15，DO 40％和80RPM）。當細胞密度到達≥5×10⁶ 個/mL時，開始誘導。誘導后，用含有誘導劑的新鮮培養(yǎng)液開始灌流模式（1VVD）5-7天。在灌流過程中，使用miniBioSep（Applikon?）細胞保留（設置1 W功率）。通過NucleoCounter?NC-200?監(jiān)測反應器每日細胞總數(shù)和活力。

在所有的灌流實驗中，合并收獲物并將含有慢病毒載體的上清液置于冰上或4℃直至澄清（每天一次），隨后儲存在-80℃直至GTA分析。由于在研究中使用了兩種規(guī)格的生物反應器，因此每升培養(yǎng)液中病毒滴度的總量（TU/L）可進行直接比較。

已介紹過通過基于流式細胞術的基因轉移分析技術（GTA）測定功能性病毒滴度（GTA滴度）的方法。即將HEK293A或293T細胞在含有5％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在用LV轉導前5小時，將細胞以1E05個/孔的密度接種于24孔板上。在轉導之前，將LV樣品在補充有8g/ mL聚凝胺的DMEM培養(yǎng)液中連續(xù)稀釋，并在37℃溫育30分鐘。移除培養(yǎng)液，并向細胞中加入200μL稀釋后的LV樣品，然后37℃培養(yǎng)過夜。第二天，每孔補加800μL培養(yǎng)液，再培養(yǎng)48小時后，使用流式細胞術定量表達GFP的細胞。因此，需在轉導后第3天測量GFP。注意，由于在對照試驗中，在轉導10天后檢測到相似的信號，因此在測量時需確定實驗中測得的GFP信號是否真正由轉基因表達，而不是附加體的存在(補充 Fig. 1)。滴度（TU / mL）使用公式[（GFP陽性細胞百分比/ 100）×（轉導的細胞的數(shù)量）×（稀釋倍數(shù)）×（1mL /轉導體積）]。在所有測量中使用內部LV標準以使批間差異最小化。

此前已經介紹了一款包裝細胞系，此細胞系除了病毒RNA外含有包裝慢病毒的所有必需基因。此包裝細胞系名為PacLV，是在單次轉染操作中同時加入所有LV組分（Gag / Pol，Rev和VSV-G）。在包裝細胞中，Rev和包膜蛋白（VSV-G）的轉錄處于四環(huán)素和cumate開關的控制下，這意味著需要在培養(yǎng)液中添加多四環(huán)素和cumate以誘導LV的產生（圖1A）。而Gag/Pol 在CMV啟動子控制下。即使Gag / Pol的表達是結構性的，并且不由開關直接控制，但其表達仍取決于REV響應元件（RERE Responsive Element，RRE）的存在。然后構建包含產生LV的所有元件（包括基因組RNA）的細胞系（稱為生產者）。為了便于滴定測定，我們選擇構建表達GFP的慢病毒載體，并且其由強組成型CMV啟動子調控?？赏ㄟ^包含RRE的pCSII-CMV5-GFPq質粒共轉染包裝細胞系來實現(xiàn)。并且先前已經報道了關于質粒構建的細節(jié)。將生產細胞系命名為clone 92。為了驗證clone 92生產慢病毒的穩(wěn)定性，將細胞在搖瓶中培養(yǎng)10周，并在不同的時間點誘導，檢測慢病毒的生產。整個過程中，慢病毒滴度均維持在3.0×10⁶TU/mL以上，表明clone 92是穩(wěn)定的（圖1B）。

為了評估clone 92在攪拌式生物反應器中的性能，在SFM4TransFx293培養(yǎng)液（該細胞系的起始基礎培養(yǎng)液）中以3.5L規(guī)模進行了4批培養(yǎng)（圖2）。誘導3天（dpi）后，細胞活力均達到70-80%，具有可重復性降低（圖2A）。慢病毒滴度生產動力學顯示，均在3dpi出現(xiàn)峰值，平均滴度為6×10⁶ TU / mL（圖2B）。從搖瓶到分批模式的生物反應器培養(yǎng)，可實現(xiàn)的線性放大（圖2C）。平均每升培養(yǎng)液的總LV產量為6×10⁹TU，具體產量為4.4TU /細胞（圖2D）。

為了解決慢病載體的低穩(wěn)定性，我們安排在灌流模式下使用連續(xù)收獲以實現(xiàn)慢病毒載體的快速生產。在預實驗中，摸索了兩種搖瓶實驗方案。首先，確定在細胞生長期期間每日更換培養(yǎng)液（DMR）的作用，并考察誘導時高細胞密度對產量的影響。在-3dpi和0dpi之間，每天使用0-100％新鮮SFM4Transfx293培養(yǎng)液進行離心換液。結果表明，通過增加新鮮培養(yǎng)液的換液量可以延長細胞生長期；連續(xù)4天換液后，當0dpi時，細胞密度可達到8×10⁶個/ mL，為批次對照的3倍（圖3A）。誘導3天后，檢測慢病載體含量，當新鮮培養(yǎng)液更換體積為75％-100％時，病毒滴度可從無培養(yǎng)液替換時的1.0×10⁶ TU / mL增加至3.35×10⁷ TU / mL，具有顯著提高（圖3B）。與100% DMR相比，75% DMR具有更高的產量。這表明在誘導條件下產生慢病毒載體的最佳細胞密度為通過75％DMR獲得的約5.5×10⁶個/ mL。

因此，在第二組小規(guī)模實驗中，細胞密度定為5×10⁶個/ mL。測試了在細胞生長階段使用強化培養(yǎng)基和在生產階段使用DMR的混合系統(tǒng)。選擇使用一種不含水解產物并且具有較低批次間差異的新培養(yǎng)液（HyCell TM TransFx-H）。每天更換75％的培養(yǎng)液，并且當細胞密度達到5×10⁶個/ mL時進行誘導，結果表明SFM4TransFx293和HyCell TM TransFx-H所得病毒滴度無差異（補充表1）。為了在分批模式下達到更高細胞密度，在HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液中補加Cell Boost（CB5），并且當細胞生長到5×10⁶個/ mL時再進行誘導；在生產階段期間，分別使用含有CB5及不含CB5的培養(yǎng)液每天更換50％(Fig. 3C)，結果表明，無論是否補加CB5均可在1dpi至3dpi得到相似的慢病毒滴度，但補充CB5卻可提高4dpi和5dpi的滴度(Fig. 3D)。數(shù)據(jù)表明，誘導前在強化培養(yǎng)基（具有CB5的HyCell TM TransFx-H）中可獲得與簡化灌流生物反應器相似的細胞密度。另外，在生產階段添加CB5可能會通過提高細胞活力以延長細胞生產期。

根據(jù)搖瓶實驗結果，選擇在進行生物反應器中灌流模式的參數(shù)。圖4為用于灌流模式下操作的示意圖。 第一組實驗（Perfusion 1）作為參考使用SFM4TransFx293培養(yǎng)液在3.5L攪拌式生物反應器中進行生長和生產。每天0.5培養(yǎng)液體積開始灌流（VVD），并在誘導后增加至1體積。

為了簡化流程，采用于搖瓶相似的混合模式實施另外三組實驗（Perfusion2-4），并且在含有CB5的1L HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液中按分批模式擴增細胞。當細胞密度到達≥5×10⁶個/mL時開始誘導，并用含有CB5和誘導劑的新鮮培養(yǎng)液按1VVD開始灌流。如圖5A和5B所示，誘導后灌流實驗1的細胞密度和活率與灌流實驗2-4具有明顯差異，并且與沒有添加CB5的圖2A、3A、3C相似，誘導后細胞活力迅速降低，在5dpi時細胞活力僅有25%并停止實驗。相比之下，灌流實驗2-4中并未停止產毒且在誘導后細胞擴增到17×10⁶個/mL，直至最終收獲時，存活率仍保持在80%以上（圖5A-B）。在灌流實驗1中，在3dpi出現(xiàn)到滴度峰值（2-3×10⁷TU / mL），而對于灌流實驗2-4，在4dpi出現(xiàn)峰值（圖5C）。在4批次灌流實驗中的總滴度均在5-8×10¹⁰TU/L范圍內，且灌流實驗1的總滴度最高（圖5D）。在生物反應器中檢測的滴度與收獲容器相當（補充圖2）。與分批培養(yǎng)相比，4次灌流實驗測得的平均滴度（2.2×10⁷TU / mL）比分批模式（6×10⁶ TU / mL）高近4倍（圖5 2B）。此外，由于每天收獲，灌流模式的所得總載體（高達8×10¹⁰ TU / L）比批處理模式多11倍（圖5B）。在分批模式中，誘導時的活細胞密度為1-1.5×10⁶個/ mL，而灌流模式中為5.4×10⁶個/ mL。與分批模式下的4.4.TU/細胞相比，灌流模式平均可達到11.5TU/細胞。

通過穩(wěn)產細胞株(clone 92)，我們制定了兩種在灌流高產實驗方案。第一種方法使用基礎培養(yǎng)液SFM4TransFx293和灌流模式來增加細胞密度和病毒載體回收（圖3A-B和5A-B）。第二種方法中使用補加CB5的HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液：由于在誘導后才開始使用灌流模式，因此該方法可能簡單更操作（圖3C-D和5C-D）?？傊c分批模式相比，灌流模式可將病毒的總產量提高至15倍。盡管預期8×10¹⁰ TU / L的絕對病毒滴度是轉基因依賴性的，但是我們推測與分批模式相比，超過1個對數(shù)的產量將可轉移到其他轉基因。

在已描述的穩(wěn)產貼壁細胞系中，病毒滴度在1×10⁶至1.5×10⁸ 范圍內。 然而，貼壁細胞系在大規(guī)模生產中存在明顯的局限性。本研究中，包裝細胞系和穩(wěn)產細胞系的母細胞系（HEK293SF3F6）已適應無血清懸浮培養(yǎng)²⁸。使用雙開關系統(tǒng)，即需要添加兩種誘導劑才可啟動病毒的合成，這是clone 92成功的一個關鍵因素，并且嚴格控制了慢病毒毒性因子的產生。在早期研究中，曾嘗試過只使用一個開關，但未獲得成功（結果未列出）。本研究中的生產細胞系可在懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)，但培養(yǎng)尚需進一步優(yōu)化。 例如，添加CB5可將高病毒滴度（> 10⁷TU / mL）時間延伸至超過4-5dpi，并且在誘導后可延緩細胞活力的下降，以維持細胞正常生長。CB5含有多種維持細胞活力的營養(yǎng)素，但某些組分（例如生長因子）可能對病毒產量產生反作用。實際上，在搖瓶實驗誘導時間段，通過比較CB5的添加情況，可以得出在每個補加CB5的孔內，所得病毒滴度相當，且均低的多（圖3C，D）。設想可通過平衡病毒生產（細胞毒素過程）與細胞狀態(tài)以開發(fā)一種連續(xù)的生產模式。 相反，在未添加CB5的SFM4TransFx293基礎培養(yǎng)液中，截止3dpi病毒均可被快速釋放（圖4C和D）。在生長階段補加CB5并在生產階段去除CB5可能進一步提高早期的產量。全面的代謝物分析以及CB5成分更詳細的分析也是有意義的，并支持在更高細胞密度下的誘導。

純化和下游加工同樣影響終產品的滴度。有研究表明，目前正在研究通過柱/膜色譜法以減少終產品中雜質的含量。雖然Cumate具有非細胞毒性，但多西環(huán)素是四環(huán)素類抗生素，因此純化過程中還應去除本研究添加的兩種誘導劑。即使終產品中只存有痕跡，但對于患有四環(huán)素過敏的人來說將會是一個大問題。

總之，據(jù)我們所知，本研究是第一個描述慢病毒載體穩(wěn)產HEK293懸浮細胞系的工藝開發(fā)和改進。從小規(guī)模到1~3L級生物反應器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。本與研究評價了兩種改善慢病毒載體總產量的方案，且這兩種方案均在灌流模式下采用了超聲波細胞過濾技術。總的來說，實現(xiàn)了總病毒滴度（TU/L每升培養(yǎng)液）超過1個對數(shù)的增加。這意味著我們能夠在灌流模式下生產高達8 x 10¹⁰ TU / L的載體。預計所開發(fā)的生產工藝很適合大規(guī)模生產和商業(yè)化制造。

圖1：Clone 92的cumate誘導系統(tǒng)和穩(wěn)定性結果。A）在包裝細胞系和clone 92中，Rev和包膜蛋白（VSVG）的轉錄受四環(huán)素和cumate開關的控制；需在培養(yǎng)液中添加四環(huán)素和cumate才可誘導慢病毒載體的產生。Cumate可阻止cumate阻遏物（CymR）與cumate操縱子（CuO）結合。多西環(huán)素促進四環(huán)素反式激活因子（rtTA2s-M2）與四環(huán)素啟動子（TR5）的結合。B）為了檢測clone 92的穩(wěn)定性，細胞在無選擇性培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)10周，并且在培養(yǎng)第2周，第6周和第10周后，取部分細胞，當細胞密度達到1.0×10⁶個/mL時，加入多西環(huán)素和cumate。通過基因轉移分析法（GTA）分析誘導后48h病毒的生成量（誤差線未標準偏差）。

圖2：分批模式下在3L生物反應器中獲得的結果。 A）使用SFM4TransFx293培養(yǎng)液及生物反應器，以分批模式進行4批獨立實驗（批次1至批次4）所測量的活細胞數(shù)量（黑線）和活力（灰線）。 B）4批次在誘導后3天內的滴度動力學。 C）在3天時，4批次生產與相應的搖瓶對照的病毒滴度結果。 內部對照即在誘導后不久從生物反應器中取樣，并分裝至搖瓶中進行罐外培養(yǎng)。 外部對照是在整個實驗期間，即生長期和病毒生產階段，在搖瓶中平行進行對照。 D）4批次實驗中，每升培養(yǎng)液所產病毒總滴度。

圖3：搖瓶實驗結果。 A）在SFM4TransFx293培養(yǎng)液中，每日培養(yǎng)液置換（DMR）0-100％后，在-4dpi和3dpi之間活細胞總數(shù)活（黑線）和活率（灰線）結果。 在-3dpi，-2dpi，-1dpi和0dpi時更換搖瓶中培養(yǎng)液。 B）通過通過基因轉移分析法（GTA）測定與圖A對應的3dpi時病毒滴度（誤差線是標準偏差）。 C）含有3.5g / L Cell Boost 5?（CB5）（方形）和不含CB5（圓形）的HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液中活細胞總數(shù)及活率。 對于生產病毒的細胞懸液，在誘導后每24h用新鮮培養(yǎng)液（補加和不補加CB5兩種條件使用獨立搖瓶）以50％進行DMR。 D）通過GTA檢測C組所示收獲液的滴度（TU / mL）（誤差線是標準偏差）。

圖4：示意圖為灌流模式中所使用的設備。使用接種瓶以0.25-0.35E06個/ mL將細胞轉移到生物反應器容器中。使用收集瓶和相關采樣器在無菌條件下進行每日無細胞收獲和采樣（使用超生過濾器保留細胞并在收獲上清液的同時將其再循環(huán)到生物反應器中）。每日從左側的采樣器取細胞并測量細胞密度和活率。將培養(yǎng)液保持在4℃并泵入容器中，使得在24小時內每反應器容積容器加入0.5-1體積的培養(yǎng)液；使用比例尺和水平檢測器可進一步監(jiān)測添加的培養(yǎng)液的確切體積。氧氣（pO2），溫度和pH值用可消毒的探針進行監(jiān)測。通過表面加入CO ₂或加入堿（NaHCO ₃）將pH維持在7.05和7.1之間。示意圖上還顯示了蠕動泵（一個圓圈中的倒三角形）。

圖5：4批灌流培養(yǎng)中細胞活力和滴度的測定結果。 在1-3.5L培養(yǎng)中誘導前后的活細胞數(shù)A）（VCC）和B）細胞活率B）。 C）使用GTA分析，4批實驗每日采收液的病毒滴度（TU / mL）（在冰上收集的灌流濾液）。 D）對于所有批次實驗1L培養(yǎng)液收獲病毒總和

補充表1：在兩種不同的培養(yǎng)基中病毒滴度結果。每日更換75%培養(yǎng)液，當細胞密度約為5×10⁶個/ mL時開始誘導細胞，并通過GTA在3dpi測量滴度。

補充圖1：

在轉導后3天和10天分別進行GFP表達定量。 兩個時間點之間沒有顯著差異。 誤差線為對應3種不同稀釋度的每個樣品3次測量的標準偏差。

參考文獻：

Manceur AP, Kim H, Misic V, et，al.Scalable Lentiviral Vector Production Using Stable HEK293SF Producer Cell Lines.Hum Gene Ther Methods. 2017 Dec;28(6):330-339. doi: 10.1089/hgtb.2017.086. Epub 2017 Nov 21.

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