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腫瘤研究依賴于模型系統(tǒng)，其在一定程度上反映了腫瘤的生物學(xué)特性。人類腫瘤的一個重要特征是腫瘤內(nèi)的基因組異質(zhì)性和不穩(wěn)定性。然而基因組不穩(wěn)定性的程度在腫瘤模型中卻很少被關(guān)注。 近年來，隨著腫瘤模型研究的不斷深入，腫瘤模型研究極大地擴展了其在腫瘤精準醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。通過建立腫瘤模型的大隊列 ( 生物信息庫 ) ，并對這些模型進行了廣泛的基因組和表型表征，來揭示患者群體水平的基因型和表型之間的關(guān)聯(lián)。患者衍生的腫瘤模型越來越多的被用在其原發(fā)腫瘤模型上，試圖預(yù)測患者特異性藥物反應(yīng)。而對于這兩種應(yīng)用，腫瘤模型不僅需要將腫瘤的來源還需要穩(wěn)定、準確、可靠的表現(xiàn)其在擴增過程中的基因組和表型特征。 然而，由于腫瘤模型的進化，腫瘤研究產(chǎn)生了另一個亟待解決的問題—— “可重復(fù)性危機”，即無法重復(fù)文獻報道的研究結(jié)果。目前只有11-25%的研究結(jié)果可以被工業(yè)化實驗室重復(fù)出來。不僅如此，大規(guī)模的腫瘤細胞系中的藥物篩選結(jié)果之間也經(jīng)常出現(xiàn)差異。  近日，Nature Cancer Review 發(fā)文：Genomic evolution of cancer models: perils and opportunities。在這篇綜述中，作者總結(jié)了腫瘤模型中基因組進化的新證據(jù)、生物學(xué)起源及功能結(jié)果；強調(diào)腫瘤模型進化對腫瘤基礎(chǔ)研究 ( 尤其是精準醫(yī)學(xué) ) 和臨床應(yīng)用的影響；并提出了可以降低基因組進化風(fēng)險的的方法。本文，帶大家深入了解。 對人類腫瘤細胞的任何功能檢測都必須依賴于患者來源的腫瘤模型，如源自患者的細胞株 ( patient-derived cell lines , PDCLs )，源自患者的類器官 ( patient-derived organoids , PDOs)以及源自患者的異種移植物 ( patient-derived xenografts , PDXs ) 。而要獲得這些模型，需要腫瘤細胞快速適應(yīng)新環(huán)境。由于不同的選擇壓力，再加上腫瘤細胞通常缺乏有效維護基因組完整性的能力，其固有的基因組不穩(wěn)定性使它們在增殖過程中極易發(fā)生基因改變或基因損傷，腫瘤模型中出現(xiàn)了那些最適合并增殖最快的癌細胞，且不斷發(fā)生改變。這就是所謂的“腫瘤模型基因組的evolution” ，在這里“evolution”是 “演變” 更是 “進化” 。因為即使在腫瘤模型中，也證明了達爾文的進化論。 即使是非患者來源的腫瘤模型，如基因工程小鼠模型(GEMMs)，也同樣會經(jīng)歷腫瘤水平和宿主水平的基因組進化。因此，腫瘤模型的進化正逐漸成為腫瘤建模的一個重要方面。 ECLs 已建立的細胞系 ( ECL ) 在培養(yǎng)中的會出現(xiàn)多樣化，這在十多年前就發(fā)現(xiàn)了，并且一些最常用的癌細胞系，如宮頸癌細胞系HeLa和乳腺癌細胞系MCF7，就是因為其經(jīng)常變異而臭名昭著。最近的研究表明，對獨立培養(yǎng)在2個實驗室 ( 美國和英國 ) 的超過100個ECLs進行比較發(fā)現(xiàn)，在2個比較的細胞株里中有1個被檢測到突變的可能性就有20％?；虮磉_的變異反映了遺傳變異，并且特定的遺傳改變通常與遺傳擾動途徑的轉(zhuǎn)錄特征相關(guān)。 PDCL 源自患者的原代細胞株 ( PDCL ) 在很大程度上保留了原發(fā)性腫瘤的基因組特征，但是在連續(xù)傳代過程中還是會出現(xiàn)拷貝數(shù)變異 ( CNA ) 。研究表明，在整個傳代過程中，約有20%的基因組在早期 ( <p5 ) 和晚期傳代 ( >p10 ) 中受到拷貝數(shù)變異的影響，并且早期CNA進化的更快。這表明模型的建立與基因組進化相關(guān)，并且模型最終在適應(yīng)新環(huán)境后變得更加穩(wěn)定。 PDX 對24種癌癥類型的543種異種移植物 ( PDX ) 模型中的CNA進行了分析，發(fā)現(xiàn)約60％的PDX模型在一次傳代中獲得至少1次大染色體畸變，并且約90％在4次傳代中獲得至少1次這樣的畸變。與PDCL中的觀察相似，基因組進化在PDX起始和早期傳代期間最快，并且其速率在后期第81代顯著降低，與強烈的選擇壓力與模型啟動相關(guān)。另外，PDX在整個傳播過程中也易受表觀基因組進化的影響。  PDO 作為新一代腫瘤模型，患者來源的類器官 ( PDO ) 更好地保留了腫瘤基因組特征，因為類器官可以更好的囊括原始腫瘤組織，而且可以減輕體外轉(zhuǎn)變的一些選擇壓力，所以PDO往往比PDCL 效果更好。研究發(fā)現(xiàn)PDO的基因組譜與原發(fā)腫瘤的基因組譜高度相似，且PDO藥物反應(yīng)可以重現(xiàn)臨床上患者的反應(yīng)。然而，與其他所有腫瘤模型一樣， PDO也不能免于體外模型的進化。由于癌細胞固有的基因組不穩(wěn)定性也可能導(dǎo)致類器官模型連續(xù)增殖過程中出現(xiàn)遺傳改變。 那腫瘤模型是如何進化的呢？總的來說，腫瘤模型進化的機制主要來源于三個方面：克隆動力學(xué)、持續(xù)的基因組不穩(wěn)定性以及由模型擴增的瓶頸影響。 在癌癥模型中觀察到的基因組進化可能是預(yù)先存在的異質(zhì)性的結(jié)果，因為預(yù)先存在的腫瘤亞克隆的克隆動力學(xué)將導(dǎo)致其相對豐度的變化。罕見的原發(fā)性腫瘤亞克隆可以擴展并成為模型中的主要亞克隆，從而改變模型的分子景觀。其次，基因組進化可能是持續(xù)的基因組不穩(wěn)定性的結(jié)果，這可能導(dǎo)致模型在增殖后有新遺傳改變的積累和固定 ( a ) 。無論腫瘤模型是否反映了先前存在的亞克隆的擴增，還是新克隆的出現(xiàn)或兩者均有，基因組進化到底是隨機還是確定性過程？這取決于它是受遺傳漂變影響還是遺傳選擇的結(jié)果 ( b ) 。另外，在任何一種情況下，與模型建立和腫瘤模型擴增相關(guān)的瓶頸 ( 包括：培養(yǎng)條件改變、凍存和解凍、遺傳操作等 ) 都能夠促進和加速基因組進化 ( c ) 。  由于選擇在塑造癌癥模型的基因組景觀中起主要作用，因此評估模型進化是否反映了患者自然發(fā)生的腫瘤進化是很重要的。來自細胞系和PDX的數(shù)據(jù)表明癌癥模型和患者中腫瘤進化會有不同軌跡。對AML ( 急性髓系白血病 ) 中基因組和功能異質(zhì)性的分析表明，AML創(chuàng)始克隆不一定是小鼠模型中的AML起始克隆。在實體腫瘤中，在原發(fā)性腫瘤中常見的復(fù)發(fā)性癌癥特異性CNA事件往往在PDXs和細胞系中消失。因此，在自然人類環(huán)境和人工模型環(huán)境下，腫瘤的基因組景觀由于不同的選擇壓力進化過程不同，導(dǎo)致癌癥模型與其起源腫瘤的逐漸產(chǎn)生基因組差異。 腫瘤模型的進化是否會轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)意義的細胞特性？答案是肯定的。癌癥模型的基因組進化對研究和臨床轉(zhuǎn)化的影響取決于它們是否會影響功能檢測的結(jié)果。 表型后果 腫瘤模型在擴增中出現(xiàn)的基因組變化以及表觀遺傳進化，會影響所有腫瘤模型的表型改變。對C57BL / 6的兩個亞株的基因工程小鼠進行表型分析表明，在多種生理、生化和行為中，兩株小鼠都具有顯著的表型差異，產(chǎn)生變化的范圍從血壓、眼睛形態(tài)一直到骨骼結(jié)構(gòu)和空間記憶等。另外，從多個實驗室收集的27株MCF7細胞系在相同培養(yǎng)條件下的倍增時間變化多達3.5倍。形態(tài)學(xué)特征，如細胞大小和形狀，也大不相同，這些形態(tài)變異就與基因組變異相關(guān)。  影響阿凡達實驗 腫瘤模型的進化還會影響“阿凡達實驗”的結(jié)果。所謂“阿凡達實驗”，也稱為共同臨床試驗，即將患者的藥物反應(yīng)與來自他們腫瘤模型的藥物反應(yīng)相匹配。這樣，用腫瘤模型測試的藥物可以幫助指導(dǎo)該患者的臨床治療過程。有一些共同臨床試驗結(jié)果表明了患者的藥物反應(yīng)與其PDX和PDO之間的高度一致性。然而，還有很多模型藥物反應(yīng)與患者反應(yīng)不匹配的情況。這種差異可能是由于基因組進化導(dǎo)致的腫瘤模型克隆組成的變化。未來還需要進一步分析以評估癌癥模型的進化以及腫瘤微環(huán)境的差異，在多大程度上限制了它們的使用以及如何克服這些限制。  影響腫瘤模型生物庫 人們使用大量的癌癥模型，目的就是為了獲得腫瘤患者群體的分子特征，并通過建立相應(yīng)的模型生物數(shù)據(jù)庫來查詢和識別與特定分子特征相關(guān)的表型 ( 例如，與基因突變相關(guān)的藥物敏感性 ) ?？傮w而言，大群細胞系，PDX和PDO反映了各自癌癥類型的基因組景觀。但是，連續(xù)傳代會使模型群體與患者群體產(chǎn)生傾斜。所以，在腫瘤模型進化的過程中建立生物庫，我們需要問這兩個重要問題：1.整個隊列在多大程度上代表了患者群體？2.這些群體中分子特征的穩(wěn)定性和可靠性如何？ 考慮到癌癥模型的建立和早期擴增期間基因組進化最快，所以在PDCL和PDX中，用于表征腫瘤特征的最佳時間點可能在p5和p10之間。還有一種新的做法，即首先生成PDX，然后從中派生出PDO。因為異種移植物的衍生成功率通常較高，而類器官更易于在高樣本量的要求下操作和研究。但是由于模型被轉(zhuǎn)移兩次，從患者到小鼠，然后從小鼠轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)中，基因組進化可能更多。  對篩選目的的影響 癌癥模型的基因組進化可以極大地影響化學(xué)和遺傳篩選。比如一些化合物對腫瘤模型的顯著作用，可能只是在這個特定的細胞系中有效果。在遺傳功能喪失實驗中，這個問題可能會加劇，這通常涉及遺傳操作和抗生素的使用。 CRISPR文庫篩選可能最容易受此問題的影響。首先，將Cas9和指導(dǎo)RNA引入細胞通常涉及兩個選擇步驟，從而實現(xiàn)更多的克隆選擇。其次，在該過程中會使細胞能夠耐受DNA切割的被選擇，從而產(chǎn)生遺傳改變。最近的兩項研究表明，CRISPR-Cas9的基因組編輯導(dǎo)致針對具有功能性p53途徑的細胞被選擇。第三，CRISPR篩選結(jié)果需要基于篩選細胞的拷貝數(shù)景觀進行校正，這通常使用親本細胞系的CNA圖譜；然而從野生型細胞株的原始分析到用CRISPR-Cas9細胞株進行實際篩選時發(fā)生的CNA進化越多，拷貝數(shù)效應(yīng)的計算校正就越不準確。  對重現(xiàn)性的影響 當(dāng)在一個實驗室中獲得的結(jié)果不能在另一個實驗室中復(fù)制時，我們應(yīng)該從中考慮一下是否是由于基因組進化產(chǎn)生的影響。例如，采用錯配的和野生型對照的C57BL/6 基因工程小鼠在Jnk2 ( 也稱為Mapk9 ) 對在肝損傷中的作用中研究結(jié)果完全相反。諸多研究都表明基因組進化可能危害癌癥研究的重現(xiàn)性，但是現(xiàn)在還不能判斷這種影響究竟有多大。 我們確定了腫瘤模型的潛在風(fēng)險，就需要就設(shè)計和實施緩解策略，以正確評估和控制基因組進化，從而減輕許多風(fēng)險。首先，對腫瘤模型在擴增過程中進行跟蹤和報告 ( 如對基因組進化進行常規(guī)檢測 ) 。 在長期擴增后或當(dāng)腫瘤模型經(jīng)歷諸如遺傳操作或單細胞克隆的強烈瓶頸時，還需要評估多樣化。由于細胞株系之間的遺傳距離與表達距離和藥物反應(yīng)距離非常相關(guān)，因此可以采用低通全基因組測序，以準確評估細胞系多樣化。在進行功能實驗的同時表征腫瘤模型的基因組特征是可取的和可行的。當(dāng)細胞系錯誤識別和支原體污染成為細胞系研究中的主要問題時，期刊開始要求作者確認細胞系身份 ( 使用DNA指紋識別 ) 和支原體污染狀態(tài)。可以設(shè)想細胞系遺傳多樣化評估可能成為未來發(fā)表文章的先決條件。 通過調(diào)整實驗方案使得基因組進化最小化，降低表型效應(yīng)。首先，在細胞初始鑒定之后，建議使用最小化的細胞培養(yǎng)技術(shù)來避免不必要的傳代；其次，保持培養(yǎng)條件盡可能恒定，因為即使是微小的變化也可能導(dǎo)致克隆選擇；另外，當(dāng)可以使用基于群體的分析時，應(yīng)該避免單細胞克隆?？傊覀冃枰玫啬７氯祟惸[瘤環(huán)境，減輕人為選擇壓力使基因組進化最小化。 這篇文章，我們回顧了腫瘤模型中基因組不穩(wěn)定性的研究現(xiàn)狀，并論述了其生物學(xué)起源及其對基礎(chǔ)研究和腫瘤精準醫(yī)學(xué)的影響。雖然癌癥模型的基因組進化的危險值得注意，但是采用緩解策略，這種自然現(xiàn)象也可以通過創(chuàng)造性方式加以利用。未來，可以利用癌癥模型的動態(tài)性質(zhì)來尋求新的研究途徑或以新的方式解決問題。 參考文獻 Genomic evolution of cancer models: perils and opportunities doi: 10.1038/s41568-018-0095-3
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