石蠟樣本在提取前需要進(jìn)行切片處理，一般需要5-6個(gè)切片，一片鏡檢確定腫瘤細(xì)胞含量，其他進(jìn)行后續(xù)提取處理。切片的薄厚程度對(duì)后續(xù)觀察和提取會(huì)有一定影響。切片過(guò)厚不利于后續(xù)染色和組織學(xué)觀察，而且組織脫蠟和蛋白酶消化困難增加；切片過(guò)薄易造成DNA的機(jī)械損傷，同時(shí)切片總面積的增加，其表面黏附的PCR抑制因子將可能增多。

為了避免FFPE樣品分子分析的問(wèn)題，樣品染色應(yīng)盡可能避免。某些染料和試劑可能對(duì)核酸造成不利影響，特別是那些用于免疫組化染色的試劑。涉及高pH和重金屬離子的染色步驟應(yīng)當(dāng)避免。如果樣品染色是必需的，則首選甲酚紫（cresyl violet），因?yàn)樗c核酸分析兼容。

為消除石蠟對(duì)DNA提取和PCR擴(kuò)增的不良影響，必須在保證不增加外源性PCR抑制因子和盡量減少DNA額外損傷的前提下對(duì)組織進(jìn)行徹底的脫蠟。在此過(guò)程中，先溶解石蠟，然后去除，暴露樣品，用于后續(xù)裂解緩沖液和蛋白酶K（如果合適）的處理。多種溶劑適用于脫蠟，如二甲苯、庚烷和檸檬烯等。二甲苯脫蠟不僅容易造成核酸片段化和得率低，而且對(duì)人有毒害，切片越厚或存放時(shí)間越長(zhǎng)，脫蠟效果越差。作為溶劑法的替代，石蠟也可通過(guò)加熱與FFPE樣品分離：熔化后，石蠟冷卻，取決于其用量，石蠟粘在管壁上，或在樣品上形成一個(gè)固體層。市面上主流試劑盒是采用無(wú)毒裂解液方法脫蠟，以及Covaris的超聲乳化脫蠟，納米級(jí)別的處理使得FFPE樣品徹底脫蠟和水化。

圖 基于AFA(adaptive focused acoustic，適應(yīng)性聚焦超聲)專利技術(shù)的Covaris系列儀器

采用高頻率短波長(zhǎng)的醫(yī)用級(jí)別超聲波，儀器與樣本不進(jìn)行接觸，球型換能器產(chǎn)生超聲聚焦作用于樣本，能量利用率極高，方向和力度精準(zhǔn)可控，處理重復(fù)性好。

圖 由于石蠟在358nm激發(fā)光下呈現(xiàn)藍(lán)色自發(fā)熒光

上圖顏色越深代表殘留的石蠟越多，中間圖表示采用超聲乳化可以徹底脫蠟。

由于FFPE樣品包含的DNA分子會(huì)彼此交聯(lián)，并與RNA和蛋白分子交聯(lián)，故這些交聯(lián)必須斷裂，才能釋放出DNA用于后續(xù)純化。如果可能的話，因交聯(lián)而引起的化學(xué)修飾也應(yīng)當(dāng)逆轉(zhuǎn)，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的DNA不能在純化過(guò)程中高效回收，而且在PCR或其他酶學(xué)分析中是一個(gè)不佳的底物。在斷裂交聯(lián)和逆轉(zhuǎn)化學(xué)修飾時(shí)必須小心，因劇烈的反應(yīng)條件可能導(dǎo)致DNA的進(jìn)一步片段化。

QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit提供了一個(gè)克服交聯(lián)的有效方法，此試劑盒是特別為FFPE樣品的基因組DNA純化而設(shè)計(jì)的。樣品先用蛋白酶K在56°C處理1小時(shí)，這一步通過(guò)消化交聯(lián)蛋白而釋放DNA。接著是優(yōu)化緩沖液中的90°C孵育，這個(gè)部分逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：在孵育過(guò)程中，氨基之間的亞甲基橋斷裂，且釋放出的甲醛分子與受體分子結(jié)合。

盡管過(guò)度加熱會(huì)導(dǎo)致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在90°C孵育1小時(shí)可實(shí)現(xiàn)可分析基因組DNA的最佳回收。數(shù)據(jù)還顯示，56°C的1小時(shí)孵育加上90°C的1小時(shí)孵育使蛋白酶K過(guò)夜孵育不再成為必需。

圖 基因組DNA的最佳回收

大鼠肝臟的FFPE切片用蛋白酶K在56°C處理1小時(shí)，之后按圖中所示的條件孵育。作為對(duì)照，一個(gè)樣品與蛋白酶K在56°C孵育過(guò)夜。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit純化基因組DNA，并利用分光光度計(jì)確定DNA產(chǎn)量。與80°C孵育和56°C的過(guò)夜孵育相比，90°C孵育實(shí)現(xiàn)了DNA的更佳回收。

圖 從FFPE組織中回收可用的基因組DNA

大鼠肝臟的FFPE切片用蛋白酶K在56°C處理1小時(shí)，之后按圖中所示的條件孵育。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit純化基因組DNA，并用QuantiTect? SYBR Green PCR Kit和Pmp2基因特異的2對(duì)不同引物開(kāi)展SYBR Green? 法實(shí)時(shí)定量PCR。生成的擴(kuò)增子為78 bp或464 bp。90°C孵育產(chǎn)生的CT值比80°C孵育更低：這表明更高溫的90°C孵育在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)上更為有效，提供了更多有用的DNA，作為對(duì)照，一個(gè)樣品與蛋白酶K在56°C孵育過(guò)夜。

在2步孵育之后，DNA可利用QIAamp MinElute? 離心柱純化：在硅膠模上分離DNA，洗滌以去除污染，之后以20-100 μl的小體積洗脫。另外，當(dāng)DNA與硅膠模結(jié)合之前，也可開(kāi)展樣品的RNase A消化。如果DNA的下游應(yīng)用對(duì)RNA污染敏感，則需要這一步。如果純化的DNA需要通過(guò)分光光度計(jì)定量，也需要RNase A消化，因?yàn)镽NA污染也會(huì)貢獻(xiàn)吸光值讀數(shù)，導(dǎo)致DNA產(chǎn)量的過(guò)高估計(jì)。