磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面，暴露在細胞外環(huán)境中。磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)位發(fā)生在凋亡早期階段，先于細胞核的改變、DNA斷裂、細胞膜起泡。體內(nèi)的吞噬細胞可通過識別磷脂酰絲氨酸來清除凋亡細胞。Annexin-V（green）是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，細胞處于調(diào)亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期壞死細胞可能為陰性），是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

PI和Annexin-V雙標： 

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。*注意：細胞凋亡時其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。 

活細胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右圖左下象限）。早期凋亡細胞因磷脂酰絲氨酸的暴露及具有完整細胞膜，故呈Annexin V-FITC染色陽性及PI染色陰性（右圖右下象限）。壞死或晚期凋亡的細胞呈Annexin V-FITC及PI染色雙陽性（右圖右上象限）。*注意：未處理的對照細胞進行常規(guī)培養(yǎng)的過程中也有一小部分的細胞死亡發(fā)生。

懸浮細胞的染色：Ⅰ、將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細胞（0.5×106）用PBS洗2次，加入200μlBinding Buffer和FITC標記的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室溫避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測（一般不超過1小時），同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。Ⅱ、貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。Ⅲ、爬片細胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡進行觀察。結(jié)果及注意事項：整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；操作時注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一個小時內(nèi)檢測；

注意事項 

1、必須活細胞檢測，不能用能破壞細胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜。 

2、特殊細胞的染色方法：在消化或吹打時，有些細胞（如神經(jīng)元細胞）很容易受到損傷，導(dǎo)致晚期凋亡或壞死比例非常高，不能反映真實結(jié)果。實驗的解決方法：先低速離心，吸取細胞培養(yǎng)板中的液體，留少許液體，加入適量PI和Annexin-V染色10min后，將漂浮細胞吸至離心管中，離心洗滌兩次，用PBS漂洗貼壁細胞兩次，加胰酶消化后將細胞懸液移至另一離心管中，離心洗滌，再與漂浮細胞合并后上流式細胞儀檢測。應(yīng)用該法可降低晚期凋

亡和壞死比例，增加早期凋亡細胞比例。 

3、由于Annexin-V為鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，只有在鈣離子存在的情況下與PS的親和力才大，因而在消化細胞時，建議一般不采用含EDTA的消化液。

4、必須設(shè)置陰性對照和補償對照（分別單染）。