縮略詞

FTO: fat mass and obesity associated

2OG:2-氧戊二酸

MA: 甲氯芬那酸

1. 肥胖癥背景、藥物及市場

根據(jù)WHO統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)的肥胖率相比1980年已經(jīng)翻倍，成年人中有19億體重超重，其中6億屬于肥胖，分別占成年人口的39%和13%，另外5歲以下兒童的肥胖人數(shù)也高達(dá)4200萬。肥胖不僅是一個美學(xué)問題，更和一些嚴(yán)重疾病相關(guān)，如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病和某些癌癥，統(tǒng)計顯示肥胖人士相比體重正常人士更容易得這些疾病。而根據(jù)NIH的調(diào)查，肥胖一般是由多因素引起的代謝失衡或紊亂導(dǎo)致，主要原因有：家族遺傳因素、不良生活習(xí)慣、身體機(jī)能失調(diào)，除了這些因素外，相關(guān)的基因可以在特定條件下調(diào)控飲食和代謝造成肥胖，當(dāng)然這個比例在不同的種族中差別也很大，至今人類基因組上大約41個基因位點(diǎn)被鑒定出來與肥胖相關(guān)，其中很多基因表達(dá)的蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，如TMEM18, KCTD15, GNPDA2,SH2B1, MTCH2和NEGR1，而FTO和MC4R也有類似的特性。

截止至15年12月，經(jīng)FDA批準(zhǔn)在美國上市的減肥藥物共6種(表1)，需要指出的是上述藥物都不是直接作用于肥胖基因編碼的蛋白。

藥物本身也可能帶來副作用，F(xiàn)DA六七十年代批準(zhǔn)上市的芬氟拉明和芬特明可能會引起心肺機(jī)能障礙，而賽諾菲公司在歐洲上市的利莫那班會導(dǎo)致部分服用者抑郁甚至自殺，上述藥物均已下架退市。

根據(jù)GlobalData的研究數(shù)據(jù),全球減肥藥市場預(yù)計將從2012年的4億多美元增長到2022年的84億美元，目前來看，這個市場還有很大的空間。

2. 新的肥胖基因Fto

2.1 Fto基因的發(fā)現(xiàn)

2007年英國科學(xué)家在和Ⅱ型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)研究中發(fā)現(xiàn)了和肥胖相關(guān)的基因Fto (fat mass and obesity associated)，Fto基因的變異增加了肥胖的概率。根據(jù)統(tǒng)計，F(xiàn)to基因發(fā)生微小變異十分普遍，大約16%的成年人存在變異，平均體重比非變異者超重3kg；其中Fto等位基因的兩個副本均變異，其肥胖率會比無變異的人高70%，而如果只有一個副本變異，則肥胖率高出30%。該現(xiàn)象在7-14歲兒童中同樣存在。此外據(jù)統(tǒng)計歐洲白人只有35％攜帶兩個正常的基因拷貝。

2.2 Fto基因編碼去甲基化酶

Fto基因編碼的蛋白屬于AlkB家族，是一種依賴于Fe2 和2-氧戊二酸(2OG)的加氧酶，催化核苷酸的去甲基化(Gerken, Girard et al. 2007)。體外實(shí)驗(yàn)證明FTO蛋白對單鏈DNA上3-甲基胸腺嘧啶(3-mT)和單鏈RNA上的3-甲基尿嘧啶(3-mU)有著明顯的底物偏好性。FTO是哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)的第9個AlkB家族蛋白，這種蛋白很多在DNA修復(fù)中發(fā)揮作用，其去甲基化酶活性是生長發(fā)育必須的，有研究發(fā)現(xiàn)該蛋白上的一個氨基酸的定點(diǎn)突變R316Q抑制了FTO的核苷酸去甲基化酶活性，會導(dǎo)致嚴(yán)重生長遲緩和多發(fā)畸形。

2.3 Fto基因敲除和過表達(dá)均導(dǎo)致異常

2009年德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)Fto基因被敲除的老鼠(Fto-/-)，和基因正常的老鼠相比，出生后2周內(nèi)生長較慢，脂肪組織和瘦肉組織較少；出生6周之內(nèi)體重比其它同類輕30％至40％。這些老鼠血液中瘦素(Leptin)濃度偏低，而脂聯(lián)素(ADPN)濃度較高，因此雖然吃得很多，不愛活動，卻很瘦。由于可以認(rèn)定Fto基因抑制新陳代謝和能量轉(zhuǎn)化成熱量釋放，其活性被抑制后攝入能量增加，不需運(yùn)動也會消耗很快。

同時牛津大學(xué)的研究人員確定了Fto基因本身過度活躍會導(dǎo)致肥胖。與正常小鼠相比，Fto基因過表達(dá)的小鼠食欲更強(qiáng)，更易飲食過量，體型也更肥碩。同樣Fto基因過表達(dá)的小鼠血液中瘦素Leptin濃度降低，導(dǎo)致攝入增加，從而引起脂肪增加和肥胖。

另外Fto基因?qū)е路逝忠泊嬖谛詣e差異，兩個Fto基因拷貝均過表達(dá)的雌性小鼠即使食譜與其它正常雌性小鼠相同，其在20周后的體重也比后者重22%，但雄性小鼠的體重差異只有10%左右。

人體內(nèi)Fto基因上存在的SNP極有可能通過增強(qiáng)Fto基因表達(dá)或是增加FTO蛋白活性的途徑引起肥胖，因此抑制FTO的活性成為研制相關(guān)減肥藥物提供了新思路。

2.4 FTO抑制劑研發(fā)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

FTO蛋白和底物3-mT的晶體結(jié)構(gòu)中，蛋白的N端具有明顯的依賴Fe2 和2OG的加氧酶活性，其R96與3-mT的O2形成的氫鍵、Glu234主鏈的氨基N原子和3-mT的O4形成的氫鍵，這些是FTO蛋白特異性識別3-甲基化修飾的U和T的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這個復(fù)合物的結(jié)構(gòu)也為設(shè)計通過干擾FTO的酶活性的小分子抑制劑提供了基礎(chǔ)。

2012年中國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)除了3-mT和3-mU外，F(xiàn)TO能夠催化6-甲基氨基腺嘌呤(m6A)的去甲基化，由于m6A普遍存在于mRNA中，因此有理由相信FTO通過影響mRNA加工來發(fā)揮功能，而這也為研發(fā)抑制FTO活性的藥物提供新的思路。

3. 抑制FTO活性的小分子研究

3.1 通用2OG加氧酶抑制劑

2OG加氧酶家族具有相似的蛋白折疊方式和保守的輔助因子及底物結(jié)合位點(diǎn)，因此抑制劑多數(shù)作為2OG的非活性類似物，通過更強(qiáng)的2OG加氧酶的結(jié)合能力或阻斷2OG的結(jié)合，從而發(fā)揮抑制作用，目前主要有N-乙二酰氨基酸類抑制劑、吡啶-羧酸類抑制劑和羥肟酸類抑制劑等。

3.2 FTO抑制劑的發(fā)現(xiàn)

由于FTO也是一類保守的2OG加氧酶，因此通用抑制劑NOG也能抑制FTO的活性。進(jìn)一步基于結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計被用于篩選適用于抑制FTO的小分子。

而通過基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)并結(jié)合高通量篩選的方法，世界上有多個研究組發(fā)現(xiàn)了多個FTO的有效抑制劑。

①大黃酸

2012年上海藥物所的研究人員篩選出大黃酸等3個化合物能抑制FTO的活性，其中大黃酸的抑制效果最好，更適合作為候選藥物分子。

在大黃酸存在的情況下FTO的去甲基化酶活性并未因Fe2 濃度加倍而恢復(fù)，表明大黃酸并沒有去螯合金屬離子。而分子模擬表明大黃酸帶正電的部分指向FTO的D233附近，而羧基指向R316附近，形成多個靜電作用和氫鍵，體外實(shí)驗(yàn)中突變該位點(diǎn)會導(dǎo)致結(jié)合能力大大下降，可以推斷大黃酸是通過和2OG競爭活性位點(diǎn)發(fā)揮抑制作用。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明大黃酸可以很好的抑制FTO對RNA中m6A的去甲基化作用，但沒有細(xì)胞毒性。

大黃酸在中藥中屬于蘆薈和大黃的主要成分之一，臨床用于治療骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病腎病等，同時具有協(xié)同抗腫瘤的作用。

②2OG類似物

2013年英國科學(xué)家用2OG加氧酶通用抑制劑即2OG類似物進(jìn)行了篩選，在FTO和這些化合物的晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)這類抑制劑通過金屬離子螯合基團(tuán)與2OG競爭

研究還發(fā)現(xiàn)脯氨酰羥化酶抑制劑FG-2216/IOX3和FG4592/SellbeckBio均能有效抑制FTO，不過這類抑制劑在開發(fā)藥物時候需避免抑制其他2OG加氧酶，提高特異性。

③意外的發(fā)現(xiàn)

2014年美國科學(xué)家在研究抗癲癇藥物時意外發(fā)現(xiàn)所得到的化學(xué)物不能有效抑制靶點(diǎn)蛋白PHD2，卻能有效抑制其2OG加氧酶家族的FTO，而且IC50值和廣譜性2OG酶抑制劑NOG接近，強(qiáng)于之前報道的大黃酸。

Fto基因的一個常見變異rs9939609可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如腦容量下降、酒精依賴等，這些病變可能與FTO的活性增強(qiáng)有關(guān)。這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，用這類化合物處理細(xì)胞可以調(diào)控miRNA的表達(dá)。FTO及其特異性底物m6A也在腦組織中大量分布；而miRNA的作用位點(diǎn)靠近富集m6A的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)，因此FTO抑制劑極有可能通過保持m6A的甲基化水平來調(diào)控miRNA，這表明除了減肥藥外FTO抑制劑還可能被研發(fā)神經(jīng)類疾病藥物。

④甲氯芬那酸(MA)——首個特異性的抑制劑

除了FTO，ALKBH5是另一個確認(rèn)的m6A去甲基化酶，二者氧化去甲基化的分子機(jī)制和化學(xué)過程均相同。由于其結(jié)構(gòu)的高度保守性，抑制劑的特異性是研發(fā)相關(guān)藥物的挑戰(zhàn)。

2014年底，上海藥物所在前期大黃酸抑制FTO去甲基化合作研究的基礎(chǔ)上，基于FTO、ALKBH5分別與DNA相互作用方式上的差別設(shè)計高通量策略篩選目標(biāo)設(shè)計的老藥分子庫，發(fā)現(xiàn)甲氯芬那酸可以有效地抑制FTO去甲基化單鏈核酸上的m6A甲基化修飾，而不影響ALKBH5的去甲基化酶活。

FTO/MA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)清晰地展現(xiàn)了FTO中β3i和β4i形成了一個特異性識別MA的疏水口袋，而ALKBH5缺乏相應(yīng)的結(jié)構(gòu)，這也解釋了甲氯芬那酸選擇性抑制FTO去甲基化的分子機(jī)制。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，MA能夠以濃度依賴方式提高細(xì)胞內(nèi)mRNA中m6A修飾水平，并且該表型與FTO的胞內(nèi)表達(dá)水平和活性密切相關(guān)，而與ALKBH5沒有直接的相關(guān)性，預(yù)示MA在細(xì)胞內(nèi)選擇性抑制FTO的去甲基化功能，而不干擾ALKBH5或者是其它RNA去甲基化酶的功能。該研究為開發(fā)特異性的FTO抑制劑提供了化學(xué)基礎(chǔ)。

⑤12號抑制劑——新型特異性抑制劑

2014年，新加坡國立大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)了幾個新型有效的FTO抑制劑，最強(qiáng)的是第12號：4-[N'-(4-Benzyl-pyridine-3-carbonyl)-hydrazino]-4-oxo-but-2-enoicacid。

FTO去甲基化酶的活性在化合物12存在的情況下并未因Fe2 濃度加倍而恢復(fù)，而在FTO和12的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，12的羧基氧與R316存在靜電作用，同時和Y295和S318存在氫鍵。另一端嘧啶環(huán)上的N原子和D234的酰胺N形成穩(wěn)定的氫鍵，這個位點(diǎn)十分關(guān)鍵，由于其他ALKB蛋白如ALKBH5中在D234位置缺乏相應(yīng)的氨基酸，12也不能有效抑制抑制這些蛋白的活性，表明12是通過特異性占據(jù)活性中心的方式抑制FTO活性。

同時細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明12的乙酰化衍生物25(胞內(nèi)可以水解成12)也可以有效的抑制細(xì)胞內(nèi)m6A去甲基化，因此12、25和甲氯芬那酸/MA一樣都是可以特異性抑制FTO活性而不影響ALKBH5，都是進(jìn)行藥物開發(fā)的理想分子。

4. 研發(fā)進(jìn)展介紹

從上文可以看出，理想的FTO抑制劑除了要抑制其本身的去甲基化活性外，還不能影響AlkB家族其他蛋白尤其是ALKBH5的活性，由于該類抑制劑基本處在臨床前研究階段，現(xiàn)根據(jù)專利申請情況總結(jié)如下:

4.1 瑞璞鑫(蘇州)生物有限公司

根據(jù)Biobay網(wǎng)站信息，瑞璞鑫生物于2014年5月成立，作為北京生命科學(xué)研究所(NIBS)在蘇州的首個產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目，核心團(tuán)隊由王曉東院士領(lǐng)銜，NIBS常務(wù)副所長智剛以及高級研究員黃牛共同組成。目前主要開發(fā)抑制FTO活性的減肥新藥，該藥物是目前世界上唯一有明確生物靶點(diǎn)的小分子化學(xué)合成藥物，屬于老藥新用途。根據(jù)目前的研究數(shù)據(jù)顯示，該藥安全性和臨床治療效果均較好，有望成為減肥藥市場的重磅炸彈產(chǎn)品。計劃三年之內(nèi)能夠完成第一代FTO抑制劑國內(nèi)新藥申報批準(zhǔn)，和海外知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)讓，在世界范圍研發(fā)和推廣該藥物。

黃牛等人采用通用的基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選以及一系列體內(nèi)外生物活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)之前被FDA批準(zhǔn)上市的恩他卡朋(entacapone)可以作為一個FTO的特異性抑制劑，得到一個已經(jīng)獲得美國專利，專利號US 2014/0148383。

4.2 上海藥物所

上海藥物所的楊財廣研究員在國際上首先發(fā)現(xiàn)大黃酸是FTO的有效抑制劑，隨后又發(fā)現(xiàn)甲氯芬那酸能夠特異抑制FTO而對ALKBH5等其他去甲基化酶沒有影響，并以此為基礎(chǔ)申請中國專利CN104069092A。

上海藥物所曾和多家國內(nèi)外制藥公司合作開發(fā)藥物，在成果轉(zhuǎn)化方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)和先天的優(yōu)勢。

4.3 新加坡國立大學(xué)

Esther Woon博士領(lǐng)導(dǎo)的研究組也發(fā)現(xiàn)化合物12及其乙?；问绞且活愄禺惖腇TO抑制分子，并正在申請美國專利US 1409405.6，正在等待審批。

首先看三個化合物抑制FTO的IC50值，三者均高于廣譜性抑制劑NOG (36.6μM)。而且從IC50看三者對ALKBH5和其他加氧酶并沒有抑制作用，可見這些藥物對靶點(diǎn)的特異性選擇已經(jīng)明顯提高。

4.4 動物實(shí)驗(yàn)

三者在體外實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果上沒有明顯差別，而在黃牛等人已經(jīng)完成的高脂肪飲食攝入誘導(dǎo)的肥胖動物模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明連續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食的大鼠(實(shí)驗(yàn)組)，如果同時攝入恩他卡朋在一段時間后體重會比未攝入的(對照組)輕11%，但是相對攝食量(用實(shí)際體重較正)沒有明顯變化。實(shí)驗(yàn)組的大鼠體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)濃度也比對照組下降了40%，同時脂肪細(xì)胞顯著變小，肝脂肪變性水平下降，預(yù)示著這些大鼠更加健康。

在LDL受體缺陷性小鼠中(ldlr-/-)，飲食中含恩他卡朋的實(shí)驗(yàn)組的主動脈竇附近區(qū)域的損傷明顯低于對照組，化合物可能在抗動脈粥樣硬化起作用。

在因連續(xù)喂食高脂食物導(dǎo)致肥胖的小鼠中，選取部分繼續(xù)喂養(yǎng)高脂食物但同時攝入恩他卡朋，其余喂養(yǎng)脂含量正常的食物，喂養(yǎng)一段時間后實(shí)驗(yàn)組的平均體重明顯下降大約10%。

這些動物實(shí)驗(yàn)表明恩他卡朋作為一種已經(jīng)上市的藥物可以被用來開發(fā)做FTO抑制劑治療脂肪代謝異常引起的肥胖。

5. 前景與展望

雖然FTO被關(guān)注是因?yàn)槠渑c肥胖有關(guān)，但是FTO在細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)的m6A等底物的去甲基化在多個生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此基于FTO的藥物研發(fā)不僅僅可以治療肥胖，還可以用于治療Ⅱ型糖尿病 、心血管疾病 、高血壓、中風(fēng)，或癌癥。例如恩他卡朋本身就是治療帕金森病的藥物，而甲氯芬那酸片適用于多種關(guān)節(jié)腫痛，二者皆是典型的老瓶裝新酒，而早先發(fā)現(xiàn)的大黃酸本身更是一種常見的中藥材。

當(dāng)然除按醫(yī)囑服用藥物，飲食、運(yùn)動和情緒等生活方式干預(yù)措施均是肥胖管理不可或缺的部分。通過這些生活方式干預(yù)，患者將獲得更大程度和更好的減重效果。

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