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2019年10月31日，國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《美國(guó)人類遺傳》（The American Journal of Human Genetics，IF：9.968）在線發(fā)表了Human Reproduction Update副主編、山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院陳子江教授團(tuán)隊(duì)與香港中文大學(xué)蔡光偉教授團(tuán)隊(duì)合作的一項(xiàng)研究（Genome Sequencing Explores Complexity of Chromosomal Abnormalities in Recurrent Miscarriage）。該研究首次使用低深度高通量全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent miscarriage，RM）夫婦進(jìn)行染色體異常診斷。與傳統(tǒng)核型分析相比，低深度高通量全基因組測(cè)序顯著提高了RM患者染色體異常診出率，確定此類患者流產(chǎn)的遺傳原因，為給予其個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。我們特別邀請(qǐng)陳子江教授團(tuán)隊(duì)，將本研究的背景、選題的初衷以及研究的體會(huì)與讀者分享，以期為大家?guī)?lái)一些科研啟發(fā)。 01 專注熱點(diǎn) 提出設(shè)想 RM是指2次或2次以上連續(xù)性的自然流產(chǎn)，人群中發(fā)生率大約5%。RM是一個(gè)重要的全球健康問(wèn)題，其病因復(fù)雜多樣，并缺乏特異性臨床表現(xiàn)，給全球數(shù)百萬(wàn)對(duì)夫婦帶來(lái)了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管各個(gè)國(guó)家與學(xué)會(huì)對(duì)RM的定義不盡相同，但是臨床醫(yī)生普遍認(rèn)為其病因主要包括遺傳因素、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、抗磷脂抗體綜合征等因素。其中遺傳因素較為明確，主要包括夫婦染色體異常和胚胎染色體異常。約2%~4%的RM夫婦中至少一方攜帶異常染色體（如平衡易位、倒位），這明顯高于一般人群中報(bào)道的攜帶率（0.3%），攜帶者在下次妊娠時(shí)可能發(fā)生流產(chǎn)的概率高達(dá)50%。2018年《中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志》發(fā)布的《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷／篩查技術(shù)專家共識(shí)》將RM確定為胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)的適應(yīng)證之一，即臨床醫(yī)生可以通過(guò)植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing for structural rearrangement，PGT-SR）幫助此類患者排除異常染色體的胚胎，降低流產(chǎn)率。 外周血常規(guī)G顯帶核型分析目前仍是染色體檢查的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其耗時(shí)費(fèi)力，要求檢測(cè)人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，并且存在分辨率較低的缺點(diǎn)（不能識(shí)別小于5 Mb的結(jié)構(gòu)變異），據(jù)此，我們提出了一個(gè)假設(shè)，即是否可以開發(fā)一種更簡(jiǎn)單高效的方法來(lái)檢測(cè)染色體異常呢？ 我們研究團(tuán)隊(duì)的前期研究（Dong Z, et al. Genet Med. 2016;18(9):940-948; Dong Z, et al. Genet Med. 2018;20(7):697-707）表明，低深度高通量全基因組測(cè)序能夠發(fā)現(xiàn)常規(guī)顯帶核型分析未發(fā)現(xiàn)的染色體易位、倒位，并且和染色體微陣列芯片比較，能檢測(cè)出額外拷貝數(shù)變異。因此，我們?cè)O(shè)想應(yīng)用這一技術(shù)，對(duì)不明原因的RM患者外周血進(jìn)行盲檢分析，了解此群體的染色體異常分布情況，以期檢測(cè)出核型分析未發(fā)現(xiàn)的染色體異常，為這部分患者的后續(xù)治療提供依據(jù)。 02 層層篩選，分級(jí)檢測(cè) 本研究招募了1090對(duì)RM夫婦，共計(jì)2180名受試者。采用低深度高通量全基因組測(cè)序檢測(cè)了1077對(duì)（98.8%，其中13對(duì)夫婦一方的DNA樣本由于儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致降解）夫婦外周血DNA，11.7%的夫婦（126/1077）檢測(cè)到了127條平衡性染色體異常，其中有1對(duì)夫婦兩人均確診染色體倒位。在這126對(duì)夫婦中，39.7%（50/126）曾經(jīng)接受常規(guī)染色體核型分析確定為正常核型，而低深度高通量全基因組測(cè)序則發(fā)現(xiàn)了額外的染色體異常，包括8例平衡易位和42例倒位（圖1）。此方法將平衡性染色體異常的檢出率從核型分析的8%（86/1077）提高到11.7%（126/1077），并確定18對(duì)夫婦存在可能和反復(fù)流產(chǎn)相關(guān)的拷貝數(shù)變異，大大提高了RM患者染色體異常的檢出率。 當(dāng)然，由于受到目前分子技術(shù)的限制，對(duì)基因組高度重復(fù)區(qū)域仍存在檢測(cè)缺陷，此方法無(wú)法檢測(cè)到包括7例羅氏易位在內(nèi)的10例平衡易位事件。這也提示，可能在現(xiàn)階段，結(jié)合核型分析和低深度高通量全基因組測(cè)序，有助于最大限度將染色體異常的檢出率提高至14.3%（154/1077）。 圖1 低深度高通量全基因組測(cè)序確定RM夫婦染色體異常的流程圖 在8例平衡易位（圖2）中，2例因?yàn)橄嗷ソ粨Q的斷裂片段長(zhǎng)度小于高分辨顯帶核型分析的分辨限度而為隱匿性易位，顯帶核型分析無(wú)法確診。以SD_RSA_11189樣本為例，全基因組測(cè)序結(jié)果顯示患者核型為46,XX,t（9;19）（q34.3;p13.3），易位涉及染色體片段大小分別為2.4 Mb和3.1 Mb；根據(jù)全基因組測(cè)序技術(shù)結(jié)果，設(shè)計(jì)PCR引物，使得產(chǎn)物跨越斷裂位點(diǎn)，經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證PCR產(chǎn)物為9號(hào)與19號(hào)染色體的衍生染色體產(chǎn)物；通過(guò)對(duì)患者重新抽取的新鮮外周血行FISH檢測(cè)，用帶有不同熒光顏色的探針雜交標(biāo)記交換染色體片段，直觀顯示衍生染色體，最終證實(shí)了全基因組測(cè)序技術(shù)報(bào)告的相互易位結(jié)果。 圖2 低深度高通量全基因組測(cè)序確定的平衡易位 此外，我們對(duì)部分再次妊娠的RM夫婦進(jìn)行隨訪研究顯示，測(cè)序核型正常的夫婦再妊娠流產(chǎn)率為22.6%（21/93），而核型異常組再次妊娠后的流產(chǎn)/胎兒異常率高達(dá)50%（5/10），這也印證了染色體異常檢測(cè)對(duì)RM夫婦再次妊娠具有指導(dǎo)價(jià)值。 同時(shí)，我們還為126對(duì)低深度高通量全基因組測(cè)序分析技術(shù)確定存在平衡易位、倒位的夫婦提供了咨詢，其中26對(duì)選擇進(jìn)行PGT干預(yù)的夫婦，與68對(duì)染色體正常的RM夫婦相比較，再次妊娠（第一個(gè)妊娠周期）發(fā)生流產(chǎn)的比例顯著降低至5.6%。因此也再次證明了，對(duì)RM夫婦進(jìn)行染色體檢測(cè)的重要性以及為攜帶異常染色體的RM夫婦提供再次妊娠干預(yù)的價(jià)值。 03 深入思考 應(yīng)用臨床 本研究結(jié)果證實(shí)低深度高通量全基因組測(cè)序分析技術(shù)提高了RM患者的染色體異常檢測(cè)效率，并為建議“不明原因”RM患者進(jìn)行PGT檢測(cè)提供了理論支持。隨著平衡易位攜帶者胚胎檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，可以有效減少染色體病夫婦的遺傳負(fù)荷（如表型正常的攜帶者的檢出）和再次流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。本研究豐富和擴(kuò)大了RM的病因診斷，對(duì)一些攜帶隱匿性平衡易位等染色體結(jié)構(gòu)異常的患者來(lái)說(shuō)，使得由針對(duì)胚胎染色體的“普篩”轉(zhuǎn)為針對(duì)額外發(fā)現(xiàn)的染色體異常進(jìn)行“精準(zhǔn)檢測(cè)”變成可能。 本研究從臨床問(wèn)題出發(fā)，研究?jī)?nèi)容主要與遺傳學(xué)的擴(kuò)大診斷密切相關(guān)，因此我們選擇投稿到《美國(guó)人類遺傳》雜志，并于近日正式在線發(fā)表。 04 循序漸進(jìn) 服務(wù)患者 本研究使用的低深度高通量全基因組測(cè)序分析方法，從檢出率以及通量（48個(gè)樣本一次實(shí)驗(yàn)）來(lái)說(shuō)，都可以有效提高臨床檢測(cè)效能。這種方法的目標(biāo)人群主要包括反復(fù)流產(chǎn)夫婦、男性不育患者以及疑似患有染色體異常疾病的患者等。未來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)會(huì)進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，提供證據(jù)支持RM患者接受全基因組測(cè)序檢測(cè)并據(jù)此進(jìn)行PGT干預(yù)能顯著降低其再次妊娠的流產(chǎn)率，結(jié)合目前的常規(guī)G顯帶核型分析和低深度高通量全基因組測(cè)序，推動(dòng)相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定。  研究團(tuán)隊(duì)簡(jiǎn)介  本文由山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院顏軍昊教授供稿 |
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