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細胞內(nèi)融合基因技術 (epicPCR) 測定功能類群多樣性

Diversity of Functional Microbes Detected by epicPCR Technology

沈文麗¹，王尚² *，鄧曄^{2, 3}

¹山東大學海洋研究院，山東大學，青島，266237；²中國科學院環(huán)境生物技術重點實驗室，中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085；³中國科學院大學資源與環(huán)境學院，中國科學院大學，北京，100049

*通訊作者郵箱：shangwang@rcees.ac.cn

摘要：細胞內(nèi)融合基因技術是一項結合了單細胞分離、融合PCR、巢式PCR和測序技術的新型分子技術，不僅可以在未培養(yǎng)的單細胞中將功能基因與系統(tǒng)發(fā)育標記基因 (如16S rRNA基因) 連接在一起，而且通量高，成本低。該技術首先通過稀釋和渦旋將樣品分散成單細胞體系，然后對擬研究的系統(tǒng)發(fā)育基因和功能基因進行融合擴增，隨后進行巢式PCR，建庫并進行高通量測序。細胞內(nèi)融合基因技術既能夠解決擴增子測序物種信息與功能信息脫節(jié)的困境，又能夠克服大規(guī)模宏基因組測序成本高、分析難且研究對象僅是優(yōu)勢物種的局限。

關鍵詞：細胞內(nèi)融合基因技術，功能基因，融合PCR，巢式PCR

材料與試劑

階段一：生成聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml、2 ml、50 ml離心管

2.PCR小管

3.35 μm細胞篩

4.0.2 μm濾膜

5.各種型號移液槍頭

6.雙蒸水

7.過硫酸銨 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: A3678)

8.N,N'-雙 (丙烯酰) 胱胺BAC (St. Louis, MO, USA, Sigma)

9.丙烯酰胺 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

10.Tris-HCl (pH 7.5)

11.氯化鉀

12.礦物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)

13.司盤80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: 85548)

14.吐溫80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: P8192)

15.四甲基乙二胺 (TEMED) (St. Louis, MO, USA, Sigma)

16.二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

17.蛋白酶K (St. Louis, MO, USA, Sigma)

18.溶菌酶 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

階段二：融合PCR

1.2 mm玻璃珠

2.2 ml小管

3.各種型號移液槍頭

4.PCR小管

5.ABIL EM 90

6.Triton X-100

7.礦物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)

8.雙蒸水

9.5× Phusion HF 緩沖液

10.超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)

11.50 mM MgCl₂

12.10 mM dNTPs

13.正向引物F1

14.反向引物R2

15.融合引物F2-R1

16.牛血清白蛋白BSA (molecular biology grade, NEB, Ipswich, MA, USA)

17.吐溫20 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

18.乙二胺四乙酸EDTA (St. Louis, MO, USA, Sigma)

階段三：破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml、2 ml、50 ml離心管

2.各種型號移液槍頭

3.雙蒸水

4.二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

5.乙酸乙酯 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

6.AMPure XP磁珠 (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA)

7.無水乙醇

階段四：巢式PCR

1.1.5 ml、2 ml、50 ml離心管

2.PCR小管

3.各種型號移液槍頭

4.雙蒸水

5.超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)

6.5× Phusion HF 緩沖液

7.50 mM MgCl₂

8.10 mM dNTPs

9.正向引物F3

10.反向引物R3

11.阻斷引物blockF

12.阻斷引物blockR

13.SYBR Green I 核酸染色試劑盒 (10,000 X, Invitrogen, Waltham, MA, USA)

表1. 本項目中融合硫酸鹽還原菌的功能基因dsrB和16S rRNA所使用的引物信息

溶液配方

1.丙烯酰胺溶液

12% 丙烯酰胺

0.32% BAC

2. 1×TK 緩沖液

   20 mM Tris HCl

   60 mM KCl

3. STT 乳化油 (14天內(nèi)可用，每次使用前需要顛倒混勻)

4.5% 司盤80

0.4%吐溫80

0.05%Triton X-100

v/v溶于礦物油中

4. ABIL 乳化油 (常溫儲存)

4% ABIL EM90

0.05%Triton X-100

v/v溶于礦物油中

儀器設備

階段一：生成聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml臺式高速離心機

2.各種型號移液槍

3.渦旋儀

4.超聲波清洗儀

5.超凈操作臺

6.通風櫥

階段二：融合PCR

1.超凈操作臺

2.渦旋儀

3.PCR儀

4.PCR管離心儀

5.1.5 ml臺式高速離心機

階段三：破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml臺式高速離心機

2.各種型號移液槍

3.通風櫥

4.磁珠清洗磁力架

5.超凈工作臺

階段四：破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.PCR儀

2.qPCR儀

3.超凈操作臺

4.各種型號移液槍

5.PCR管離心儀

實驗步驟

一、生成聚丙烯酰胺凝珠

1.細胞懸浮液準備

通過ATP等方法對樣品細胞懸浮液的濃度進行定量檢測，稀釋得到30 μl包含1,400萬個細胞的樣品懸浮液。

2.制備聚丙烯酰胺凝珠

2.1混合30 μl細胞懸浮液 (1,400萬個細胞) 、200 μl丙烯酰胺溶液 (12%丙烯酰胺和0.32% BAC) 和25 μl過硫酸銨溶液 (10%) ，輕輕渦旋混勻。

2.2在2 ml圓底離心管中，加入STT乳化油600 μl，然后加入2.1混合所得的水性懸液 (體積255 μl) ，3,000 rpm渦旋30 s，產(chǎn)生約5億個液滴 (按照液滴平均直徑10 μm計算) 。

注：STT乳化油由司盤80、吐溫80、聚乙二醇單辛基苯基醚和礦物油配置完成后14天內(nèi)可用，每次使用前需要顛倒混勻。

2.3加入四甲基乙二胺 (TEMED) 25 μl，催化聚合反應，3,000 rpm渦旋30 s。

2.4乳化液靜置90 min聚合，生成如圖1所示的聚丙烯酰胺凝珠。

3.二乙醚提取聚丙烯酰胺凝珠

3.1在2.4乳化液中加入水飽和二乙醚800 μl，立即輕彈顛倒混勻，形成可見沉淀；用移液槍移走乳化油和乙醚的混合物，添加1 ml超純水，顛倒離心管混勻。

3.2將所有樣品轉(zhuǎn)移至新離心管中，離心12,000 x g 30 s，形成上層油層、中間水油混合層和下層聚丙烯酰胺bead。

3.3采用移液槍移取上層油層后，加入超純水洗滌，顛倒混勻，繼續(xù)用移液槍移取油層；重復加入超純水洗滌至不再有油層形成 (約5次) ；在最后一次水洗不再形成油層時，采用移液槍移取上層水。

3.4注入1 ml 1× TK緩沖液，重懸浮珠子于緩沖液中；用35 μm細胞過濾器過濾，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，過濾完成的聚丙烯酰胺凝珠保存于4 °C。

圖1. (a) 下層白色膠質(zhì)物為生成的包裹細胞的聚丙烯酰胺凝珠；(b) 熒光顯微鏡下聚丙烯酰胺凝珠及其中包裹的單細胞微生物

4.細胞溶解 (可選)

添加0.8%的溶菌酶 (35,000 U/μl) ，于37 °C過夜培養(yǎng)。離心，移除上清；重懸浮在1× TK緩沖液中。用20%蛋白酶K (1 mg/ml) 和0.8%TritonX-100處理，37 °C培養(yǎng)30 min，然后95 °C培養(yǎng)10 min，重懸浮在1× TK緩沖液中。

二、融合PCR

1.配制PCR反應混合體系，各組分的體積為1.1倍樣品數(shù)。

2.每個樣各分裝55.2 μl混合液到2 ml 離心管中，加入45 μl合成的聚丙烯酰胺凝珠，混合均勻。加入900 μl ABIL油，3,000 rpm渦旋1 min，充分振蕩混勻。

3.分裝60 μl反應混合液到PCR小管中，每個樣約分裝16管。然后進行PCR：94 °C 30 s, [94 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 33個循環(huán), 72 °C 5 min, 4 °C ∞。

4.反應結束后，立馬將融合產(chǎn)物收集到1.5 ml離心管中 (將融合產(chǎn)物跑電泳，通常看不到任何產(chǎn)物條帶，如圖2所示)。在每個收集的樣品中，加入終濃度為1 mM的EDTA，該樣品可在4 °C保存過夜。融合產(chǎn)物跑水平電泳通?？床坏饺魏螚l帶，如圖2所示。

圖2. 融合PCR后產(chǎn)物跑膠圖

三、破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.破壞ABIL乳化體系，釋放凝珠

1.1將階段二生成的融合PCR產(chǎn)物在常溫下13,000 x g 離心5 min，棄上層油相。

1.2加入1 ml水飽和二乙醚至每個樣品中， (同體積水-乙醚混合液，混勻過程中輕起瓶蓋放氣) ，輕輕渦旋混合，13,000 x g 離心1 min，棄上層液相，重復該步驟一次。

1.3同樣的方法，用水飽和乙酸乙酯清洗2次。

1.4放在通風櫥中吹10 min，使殘留的二乙醚盡可能揮發(fā)干凈，約收集100-150 μl產(chǎn)物。該產(chǎn)物可在4 °C保存數(shù)小時，在-20 °C保存過夜。

2.磁珠清洗PCR產(chǎn)物

2.1將磁珠充分搖勻，至于室溫中平衡至室溫 (10 min左右即可，最多30 min足夠) ，每100 μl DNA樣品中加入85.5 μl磁珠于1.5 ml離心管中，輕輕混勻，在室溫中孵育13 min，使DNA充分結合到磁珠上。

2.2將離心管置于磁鐵上，分離磁珠2 min，移除懸液 (不要將離心管取下) 。

2.3用0.5 ml 70%乙醇清洗磁珠2次 (不要將離心管取下) 。

2.4離心管保留在磁鐵上，打開離心管蓋子，風干15-30 min，直至管壁上沒有液滴，磁珠表面干燥。

2.5將離心管從磁鐵上取下，加入40 μl的緩沖液或無菌水，輕輕混勻，室溫中孵育7 min。

2.6將離心管置于磁鐵上2 min，收集35-40 μl懸液，保存在1.5 ml離心管中。

四、巢式PCR

1.巢式qPCR (可選)

1.1配制反應混合液，各組分的體積為1.1倍樣品數(shù)

1.2每個樣分裝23 μl混合液至PCR小管中，加入2 μl純化的融合PCR產(chǎn)物以及水 (作為陰性對照) 。

1.3輕彈反應液使混勻，將PCR管置于PCR管離心儀上離心片刻。進行PCR過程：98 °C 30 s, [98 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 40個循環(huán), 72 °C 5 min, 4 °C ∞。

1.4根據(jù)qPCR Ct值評估不同樣本的最少循環(huán)數(shù)，可通過稀釋高濃度樣本，使不同樣本的循環(huán)數(shù)一樣。該PCR產(chǎn)物可在4 °C保存數(shù)小時或者-20 °C過夜保存。

2.巢式PCR

2.1配制反應混合液，各組分的體積為4× 1.1倍樣品數(shù)

2.2每個樣分裝63 μl混合液至PCR小管中，加入37 μl純化的融合PCR產(chǎn)物 (根據(jù)qPCR結果進行稀釋) ，輕輕混勻，然后以25 μl體積進行分裝。

2.3進行PCR過程：PCR：98 °C 30 s, [98 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 40個循環(huán) (循環(huán)數(shù)根據(jù)qPCR結果確定) , 72 °C 5 min, 4 °C ∞。

3.將同一樣品的平行樣收集到1.5 ml離心管中，可以先用5 μl樣品跑水平凝膠電泳，觀察生成目標產(chǎn)物情況 (如圖3所示)。若生成目標產(chǎn)物，將樣品跑膠然后割膠純化，再用磁珠清洗 (方法同階段三步驟2) ，最后送測序。

圖3. 巢式PCR產(chǎn)物跑膠圖 (其中黃色箭頭所指為產(chǎn)物條帶)

結果與分析【可選】

本課題組采用細胞內(nèi)融合基因技術 (epicPCR) 對采集自十個西藏鹽湖底泥的硫酸鹽還原菌群落的系統(tǒng)分類和多樣性進行了鑒定，并對影響該群落結構的環(huán)境因子進行了鑒別。研究發(fā)現(xiàn)了十個新的硫酸鹽還原菌門，并由此表明，環(huán)境中尚有大量的未知硫酸鹽還原菌群類別?？蓞⒁娙缦陆Y果：

1.通過對融合的16S rRNA加dsrB基因的16S rRNA擴增子和epicPCR產(chǎn)物的測序，共檢測到10個湖泊的微生物總群落的12,519個OTU和硫酸鹽還原菌群的883個SRP OTUs (表5) 。在微生物總群落和硫酸鹽還原菌類群中，變形桿菌、厚壁菌和擬桿菌是最主要的門，包括了最大比例的OTUs代表 (圖4) 。整個微生物群落和SRP亞群落的α-多樣性呈顯著正相關 (R2=0.443，P<0.05) ，β-多樣性部分重疊 (圖5) ，揭示了兩者間的關系。

表5. 對西藏鹽湖中微生物總群落和硫酸鹽還原菌群落的門，屬，以及OTUs水平的結構比較

圖4. 微生物總群落和硫酸鹽還原菌群落的OTUs的門的水平分類。外餅為微生物總群落，內(nèi)餅為硫酸鹽還原菌群落。

圖5. 微生物總群落和硫酸鹽還原菌的α-多樣性 (a) 與β-多樣性 (b) 的對比

2.按照epicPCR最初創(chuàng)始文章的方法，篩選出了120個高豐度的SRP-OTU (至少一個樣本中為1%) ，并對其構建了進化樹以觀察進化分化 (圖6) 。這些高豐度的SRP-OTU與17個描述的門相關，其中只有7個廣為認可的SRP門。類似于微生物總群落的大多數(shù)OTUs，大多數(shù)SRP-OTUs只存在于某個特定的湖泊中， 證明了在西藏鹽湖中微生物群落和SRP亞群落的分布的地方特殊性。

圖6. 120個高豐度的硫酸鹽還原菌的OTUs的進化關系。加黑字體為參考序列，藍色字體為廣泛分布的OTUs (每一個湖中均有高豐度存在) ，黑色字體為只以高豐度存在于某一個湖中的OTUs，紅色字體為高豐度存在于兩個以上的湖，但并不在每個湖中都有的OTUs。進化枝上藍色圓形大小表示自展值的大小 (70-100) 。紅色進化枝代表屬于新發(fā)現(xiàn)的十個硫酸鹽還原菌門的OTUs (圖下方 * 標記的菌門) 。黑色柱形代表該OTUs相對豐度最高的湖中的豐度。彩色條形標記門的水平的分類。

致謝

感謝自然科學基金重大研究計劃培育項目 (項目號91851106) 以及國家自然科學基金青年基金項目 (項目號32001092) 的經(jīng)費支持！感謝MIT研究團隊Spencer等人，該實驗方案參考自Spencer等人于2016年發(fā)表在ISME Journl上的文章以及他們提供的詳細的實驗流程，在此表示特別感謝！

參考文獻

1.Spencer S J, Tamminen M V, Preheim S P, Guo M T, Briggs A W, Brito I L, D A W, Pitkanen L K, Vigneault F, Juhani Virta M P, Alm E J. Massively parallel sequencing of single cells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. ISME J, 2016, 10: 427-436.

2.Qin H, Wang S, Feng K, He Z, Virta M P J, Hou W, Dong H, Deng Y. Unraveling the diversity of sedimentary sulfate-reducing prokaryotes (SRP) across xizangan saline lakes using epicPCR. Microbiome, 2019, 7: 71.