Nature：二甲雙胍通過PEN2激活溶酶體AMPK途徑

新用戶0641yy4L 2022-09-08 發(fā)布于河南

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二甲雙胍是臨床治療2型糖尿病的首選藥物，具有價格低廉、降糖效果好且副作用小等優(yōu)勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了降低血糖，二甲雙胍在緩解脂肪肝、保護心血管、降低癌癥發(fā)生風險及緩解神經(jīng)退行性疾病癥狀等方面也展現(xiàn)出一定療效。此外，對于健康人群，二甲雙胍也表現(xiàn)出延緩衰老和延長壽命的作用。因而二甲雙胍也被稱為“神藥”，它經(jīng)常和卡路里限制一起，被列為人類未來通向健康長壽之路的重要手段之一。

然而，長久以來，二甲雙胍發(fā)揮作用的直接分子靶點一直不清楚。二甲雙胍作用于肝臟、腎臟和腸道等器官，在轉運入細胞后，主要通過激活AMPK信號通路來發(fā)揮其降糖、降脂等重要生物學功能。AMPK是人體能量代謝穩(wěn)態(tài)調節(jié)中樞，但是二甲雙胍激活AMPK的分子機制一直不明確。

此前有研究表明，二甲雙胍通過抑制線粒體電子傳遞鏈復合體I，從而提升AMP水平，通過經(jīng)典的AMP依賴的方式激活AMPK來發(fā)揮功效。但相關實驗使用的二甲雙胍濃度遠高于臨床劑量，且均是體外實驗，因此這一信號通路并不能解釋臨床用藥獲益的實際效應。

廈門大學生命科學學院林圣彩團隊長期致力于代謝穩(wěn)態(tài)和代謝疾病發(fā)生機制研究，提出二甲雙胍對AMPK的激活可能是“另辟蹊徑”的，其可能以一條全新的、不依賴于AMP的通路來激活AMPK。2016年，其團隊在《Cell Metabolism》發(fā)文表明，二甲雙胍可能通過他們先前發(fā)現(xiàn)的溶酶體途徑激活AMPK，為二甲雙胍的功效行使指明了粗略方向。2022年2月24日，林圣彩院士團隊在《Nature》上發(fā)表了題為“Low-dose metformin targets the lysosome–AMPK pathway through PEN2”的研究論文，找到了二甲雙胍的直接作用靶點PEN2（γ-secretase的亞基），并闡明了其通過與跨膜蛋白v-ATPase的ATP6AP1亞基結合，進而激活溶酶體AMPK通路發(fā)揮生物學效應的分子生物學機制。

1、臨床劑量二甲雙胍激活AMPK不通過經(jīng)典AMP依賴途徑

首先研究人員以人類服用臨床劑量二甲雙胍后，血漿及肝臟中二甲雙胍的濃度校準獲得小鼠及不同細胞中的處理條件，以模擬臨床劑量二甲雙胍的效應。作者發(fā)現(xiàn)臨床劑量二甲雙胍可以直接抑制小鼠原代肝細胞中v-ATPase的活力，激活AMPK，然而AMP/ATP和ADP/ATP比值未發(fā)生變化，即臨床劑量二甲雙胍在不改變細胞內能量水平的情況下激活AMPK。

2、二甲雙胍結合PEN2激活AMPK

為了尋找和二甲雙胍直接作用的分子，研究人員突破了多個化學合成的難題，合成了一種光活性二甲雙胍化學探針（Met-P1），它可以像釣魚一樣，釣出能與二甲雙胍結合的蛋白。通過這種方法，他們從細胞中“釣”到3042種可能和二甲雙胍結合的蛋白；由于二甲雙胍可以獨立地通過溶酶體途徑激活AMPK，作者通過查閱資料發(fā)現(xiàn)這3042種蛋白中有219種為溶酶體駐留蛋白，58種被報道和溶酶體有關的蛋白。此外，為了避免在質譜分析中由于蛋白低表達水平低或胰蛋白酶消化不良可能導致的遺漏，作者另增加90種已知溶酶體蛋白，共計選出367種蛋白進行下一步驗證。作者在HEK293T細胞中逐一過表達這些蛋白，通過pulldown實驗一一驗證這些蛋白與Met-P1的相互作用，找到113種與二甲雙胍結合的蛋白；通過慢病毒介導的shRNA將MEFs細胞中這113種蛋白逐一敲低，發(fā)現(xiàn)其中只有一個蛋白PEN2敲低后，臨床劑量二甲雙胍無法激活AMPK。作者進一步確認在小鼠原代肝細胞、MEFs細胞和HEK293T細胞中敲除PEN2會阻斷臨床劑量二甲雙胍誘導的AMPK激活。綜上所述，PEN2能夠結合二甲雙胍并介導臨床劑量二甲雙胍激活AMPK信號。

接著研究人員通過差示掃描量熱法（DSC），等溫量熱法（ITC）, 表面等離子共振法（SPR）及肽指紋（PMF）等一系列物理化學實驗證明二甲雙胍結合在PEN2的F35和E40位點。同時pull down實驗證實PEN2-2A（F35和E40）突變體不能與Met-P1結合，并且在PEN2^-/-MEFs細胞中回補PEN-2A突變體后，臨床劑量二甲雙胍無法激活AMPK。作者通過隨機光學重建顯微鏡，共聚焦顯微鏡及透射電鏡發(fā)現(xiàn)部分PEN2定位在溶酶體上；分別在PEN2^-/-MEFs的溶酶體、線粒體、內質網(wǎng)以及高爾基體中特異性表達PEN2，只有表達在溶酶體上的PEN2介導臨床劑量二甲雙胍激活AMPK。這些結果表明，溶酶體中的PEN2結合二甲雙胍激活AMPK信號。

3、PEN2通過與ATP6AP1作用進而激活溶酶體AMPK

明確二甲雙胍靶向PEN2后，作者進一步探索PEN2是如何參與溶酶體AMPK激活過程。研究人員使用免疫沉淀質譜聯(lián)用（IP-MS）技術尋找PEN2相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)了ATP6AP1蛋白，這一蛋白是溶酶體AMPK信號通路中關鍵蛋白v-ATPase的亞基。作者在細胞和純體外條件驗證了PEN2與ATP6AP1之間的二甲雙胍依賴性結合。作者進一步在HEK293T細胞中轉入帶有myc標簽的不同ATP6AP1截短質粒，通過免疫沉淀技術尋找與PEN2結合的ATP6AP1特定區(qū)段，發(fā)現(xiàn)ATP6AP1跨膜結構域的420至440位氨基酸殘基負責與PEN2結合。在ATP6AP1^-/-MEFs細胞中回補ATP6AP1^Δ420–440突變體后，臨床劑量二甲雙胍無法激活AMPK。此外通過軟件模擬分析，作者發(fā)現(xiàn)PEN2有20個氨基酸殘基負責和ATP6AP1結合，同時PEN2-20A突變體不與ATP6AP1發(fā)生二甲雙胍依賴性結合。而在PEN2^-/-MEFs細胞中回補PEN2-20A無法介導臨床劑量二甲雙胍激活AMPK。綜上所述，二甲雙胍通過PEN2與ATP6AP1的結合作用進而激活溶酶體AMPK。

4、臨床劑量二甲雙胍發(fā)揮生物學作用依賴于PEN2和ATP6AP1的參與

闡明二甲雙胍激活AMPK的分子機制后，研究人員進一步在模式生物中對二甲雙胍的一系列效應進行分析。首先他們在小鼠腸道細胞中敲除PEN2（PEN2-IKO），口服糖耐量實驗（OGTT）結果顯示，在PEN2-IKO小鼠中二甲雙胍的降糖效果顯著減弱；在小鼠肝臟中敲除PEN2（PEN2-LKO），發(fā)現(xiàn)PEN2-LKO小鼠中二甲雙胍對肝臟脂質堆積的改善作用大大降低，OGTT實驗顯示其降糖效果也受到影響；在秀麗隱桿線蟲中敲低PEN2，生存曲線分析顯示，在PEN2敲低組中二甲雙胍不再具有延長壽命的作用。上述結果表明二甲雙胍激活AMPK信號改善血糖、脂肪肝、延長壽命的生物學效應均依賴于PEN2。

此外，在小鼠肝臟中敲除ATP6AP1，并引入不與PEN2結合的△420-440突變體后，二甲雙胍的降脂和降糖作用均明顯降低；類似地，秀麗隱桿線蟲中，其延壽作用消失。最后，研究人員利用小鼠飼料中添加0.1%二甲雙胍以激活AMPK延長小鼠壽命、延緩衰老的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除肝臟PEN2或ATP6AP1并引入ATP6AP1^Δ420-440后，二甲雙胍在敲除組的AMPK激活被顯著抑制。這些結果表明二甲雙胍發(fā)揮其生物學作用需要PEN2和ATP6AP1的參與。

總結：

該研究發(fā)現(xiàn)當臨床低劑量的二甲雙胍進入細胞內后，與溶酶體膜上PEN2結合，PEN2進一步與ATP6AP1相互作用，抑制v-ATPase的活力，從而激活溶酶體途徑AMPK信號，發(fā)揮相應的生物學效應，如降糖，降脂及延長壽命等。本項工作是二甲雙胍研究的里程碑式工作，闡明了二甲雙胍的作用靶點和作用機制，為糖尿病等代謝性疾病的治療，乃至抗腫瘤、抗衰老、延壽的藥物研發(fā)和應用提供了嶄新的思路和可靠的理論依據(jù)。