人芽囊原蟲(Blastocystis hominis B.h.)是一種常見的人與動物腸道寄生蟲。于1849年首次報告,1912年從人體糞便中發(fā)現(xiàn),根據(jù)其形態(tài)特征歸屬于酵母菌,并命名為人體酵母菌,其后,在哺乳類、鳥類、爬蟲類、兩棲類及昆蟲類都得到檢出。B.h.一直被認(rèn)為是一種對人體無害的酵母菌,1976年有學(xué)者進(jìn)一步對形態(tài)特征進(jìn)行了光鏡與電鏡區(qū)別。根據(jù)其性質(zhì)、生理和形態(tài)體征發(fā)現(xiàn),B.h.嚴(yán)格厭氧,采用培養(yǎng)細(xì)菌或真菌的培養(yǎng)基不能生長,營養(yǎng)類似原蟲,室溫培養(yǎng)3d死亡,pH 7環(huán)境生長,無細(xì)胞壁,具有偽足和原蟲線粒體等特點 。1996年以后進(jìn)行分子生物學(xué)的研究,人體分離蟲株間的遺傳性顯示了多形態(tài)特點。目前,確定B.h.分為9個遺傳子類型,另在鳥類、哺乳類同樣亦可檢出,確定其為人畜共患病原菌 。為提高B.h.檢出率,本研究重點就B.h.形態(tài)學(xué)鑒定、方法與B.h.病進(jìn)行綜述。

1 流行病學(xué)與檢出率

B.h.世界均有報告,高發(fā)于熱帶和亞熱帶地區(qū)。廣西省地處亞熱帶,氣候溫暖潮濕,是多種寄生蟲病流行的重要地區(qū)。近年研究表明,B.h.感染在廣西人群中較常見。但是,臨床醫(yī)師對惡性腫瘤患者B.h.感染認(rèn)識不足,易漏診或誤診,導(dǎo)致惡性腫瘤患者的病情加重。

吉川尚男認(rèn)為:由于檢查方法不同(如直接鏡檢、染色檢查、培養(yǎng)檢查),檢查對象和鑒定水平存在差異,各地區(qū)檢出率差異性較大。美國為22.9%,英國為6.9%(96/1390),日本采用糞便碘染色鏡檢+直接涂片檢查+姬姆薩染色檢查陽性率為0.47%(30/6422)。其采用培養(yǎng)方法,提高陽性率為2.45%(50/2037),并強調(diào)反復(fù)多次檢查慢性腹瀉的患者糞便檢出率高。張峰等介紹,我國有幾十個省市報道有B.h.感染。

筆者注意到20世紀(jì)70~90年代一直以B.h.無致病性處理。在日常糞便常規(guī)寄生蟲檢查中,以鐵蘇木素染色,油鏡觀察,檢出率為45.0%,曾強調(diào)腹瀉患者更為多見,并指出一般鏡檢容易與白細(xì)胞混淆。

近年胡纓等對就診的1185例慢性腹瀉患者進(jìn)行糞便檢查,B.h.感染率為12.24%,其中有黏液膿血便患者感染率顯著高于其他類型腹瀉者(P<0.05);不同性別、年齡腹瀉者間感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);農(nóng)民感染率最高(為20.29%)。實驗室輔助檢查中,69.66%的感染患者中有血紅蛋白降低;80.69%的感染患者IgG、IgM、IgA均正常;86.90%的感染者CD3+、CD4+表達(dá)水平降低,CD8+表達(dá)水平相對穩(wěn)定,CD4+/CD8+比值下降。結(jié)論認(rèn)為,B.h.感染是慢性腹瀉的1個重要病原體,其致病作用不容忽視。

全國人體重點寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查SWOT分析(2015)認(rèn)為 :寄生于人體且致病的腸道原蟲常見有溶組織內(nèi)阿米巴、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲和B.h.等,上述寄生蟲是引起人體腹瀉、腹痛的主要病原體。目前,B.h.在全世界依然被列為威脅人類健康的10種主要寄生蟲病之一,其感染潛在危害較大,且易與一般胃腸道感染相混淆,容易漏診或誤診,嚴(yán)重時可危及生命。

2 生活史

長期以來,B.h.生活史尚不清楚,造成對其形態(tài)和致病性不明確。近期研究認(rèn)為,B.h.通過3種方式進(jìn)行發(fā)育與繁殖:顆粒型方式、空泡型方式、阿米巴型方式。見圖1。如何使滋養(yǎng)體形成空泡型,顆粒型營二分裂繁殖及形成包囊型,至今不明 。可從宿主糞便培養(yǎng)中看到,包囊型分化成空泡型與顆粒型。由于作為具有感染性質(zhì)的包囊型在人體盲腸和大腸內(nèi)形成與寄居,人工培養(yǎng)不能造成腸道微環(huán)境,故在培養(yǎng)基中看不到包囊型。包囊隨著糞便排出外界后,經(jīng)口食入感染,在人體腸腔內(nèi)脫囊,才能形成空泡型與顆粒型B.h.,而后,其再進(jìn)行分裂、繁殖和增生,完成生活史。因此,包囊型發(fā)育成為空泡型與顆粒型只有在宿主腸道內(nèi)才可看到,體外人工培養(yǎng)不可能完成包囊型B.h.。

注:空泡型見于生活史的底部(通常在臨床標(biāo)本中可以看到);顆粒型的發(fā)育見于生活史圖的左側(cè)部分;阿米巴型見于生活史圖的右側(cè)部分。顆粒型與阿米巴型的蟲體均可以由空泡型(中心體)產(chǎn)生而來;增殖可通過二分裂(空泡型和顆粒型)、出芽(形成阿米巴型)、裂體生殖(中心體)和孢子形成(空泡型,少見)而發(fā)生。

圖1 B.h.生活史

3 形態(tài)學(xué)特征描述

吉川尚男報告,目前共識有3類型B.h.:空泡型、顆粒型和阿米巴型?？张菪团c顆粒型的不同之處在于蟲體中心部位有無液泡,空泡型蟲體內(nèi)所呈液泡為無構(gòu)造和類似細(xì)胞液泡樣的均勻物質(zhì),而顆粒型則可以看到蟲體中心部位有顆粒樣物質(zhì)存在,此為區(qū)別兩者依據(jù) 。見圖2、3。阿米巴型最顯著特點為形態(tài)不規(guī)則,見圖4。其有偽足和偽足運動,但運動相當(dāng)緩慢,細(xì)胞核內(nèi)含有空泡和顆粒。顆粒型蟲體也能以二分裂方式繁殖。何妮等描述,空泡型直徑3~64μm,大小差異懸殊,折光性強,蟲體透明,活體時細(xì)胞核不可見,細(xì)胞內(nèi)有1個極大空泡結(jié)構(gòu)。1990年研究報告B.h.還存在包囊型,直徑為2~5μm,囊壁厚。不同來源的宿主其包囊形態(tài)不同。

注:中央有巨大空泡,核緊靠邊緣。

圖2 空泡型蟲體模式

注:細(xì)胞呈泡狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含大量大小不一、功能不詳?shù)念w粒,核靠近邊緣。

圖3 顆粒型蟲體模式

注:形態(tài)不規(guī)則,有偽足、核邊緣化,中央有空泡和顆粒。

圖4 阿米巴型蟲體模式

4 顯微鏡不同倍率檢查與形態(tài)特征

4.1 低倍鏡檢查

筆者采用生理鹽水直接糞便涂片低倍顯微鏡觀察,B.h.為無色或淺黃色,圓形或卵圓形,大小不一,數(shù)量多時視野可呈“滿天星”點狀。內(nèi)含1個巨大透明體,其周圍圍繞以極小細(xì)胞質(zhì),在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可看到有少數(shù)折光小體(顆粒),遇到普通水或蒸餾水可以迅速破裂而消失,見圖5(僅見蟲圖輪廓)。

圖5 患者糞便標(biāo)本低倍觀察

4.2 高倍鏡檢查

在光鏡下(40×10),生理鹽水涂片中B.h.為圓形、卵圓形,無運動現(xiàn)象,核及其他結(jié)構(gòu)不易辯認(rèn),不易與其他腸道原蟲包囊區(qū)別;可見3類型:空泡型、顆粒型和阿米巴型。新鮮糞便標(biāo)本立即涂片可觀察到直徑為5~50μm的空泡型和顆粒型蟲體,見圖6。此外,還可檢出直徑為3~5μm的包囊型蟲體,通常小型蟲體光鏡觀察比較困難。

注:培養(yǎng)的蟲體在中央均有液泡(CV)。具有圓形小顆粒為顆粒型(GF);無顆粒者為空泡型(VF)。

圖6 B.h.普通光鏡(A)與相差顯微鏡(B)觀察

排出糞便后,放置4h再進(jìn)行糞便涂片時,空泡型與顆粒型蟲體不能維持原來形態(tài),此為B.h.嚴(yán)格厭氧性質(zhì)決定。蟲體排出后接觸空氣,會發(fā)生急劇變性和裂解,見圖7。變性的空泡型與顆粒型蟲體與原本不固定的阿米巴型蟲體很難區(qū)分。從糞便標(biāo)本中檢出特殊的阿米巴型就比較困難 。

注:在蓋玻片周圍的蟲體,由于接觸空氣(氧氣)導(dǎo)致蟲體裂解,呈形態(tài)空化、溶解(A)。再延時后,可以完全變性,細(xì)胞膜呈纖維狀,其中央呈顆粒聚焦現(xiàn)象(B),完全溶解。

圖7 培養(yǎng)中蟲體,呈變化的多態(tài)性

空泡型與顆粒型不同點在于依細(xì)胞中心位置的液泡,空泡型呈均勻無結(jié)構(gòu),顆粒型則具有細(xì)小顆粒物質(zhì)。在高倍光鏡下僅從中央液泡就可區(qū)分兩者形態(tài)差異,但電鏡觀察并不顯著。

4.3 油鏡檢查

B.h.低、高倍率顯微鏡顆粒型,不易與腸道內(nèi)較小原蟲、哈門內(nèi)阿米巴、脆弱雙核阿米巴等區(qū)別。用鐵蘇木素染色光鏡(100×10)觀察,B.h.形態(tài)多樣,可見空泡型、顆粒型、阿米巴型及二分裂型。其中以空泡型多見,蟲體顯示出顯著囊壁,中央有清楚和染色較深的區(qū)域?qū)⒑送葡蛳x體邊緣,核染成深藍(lán)色,多在3個以上。見圖8、9。

圖8 鐵蘇木素染色光鏡(100×10)觀察B.h.空泡型,核邊緣化

圖9 鐵蘇木素染色光鏡(100×10)觀察B.h.空泡型,核邊緣化

4.4 瑞姬方法染色

空泡型蟲體,形態(tài)多樣化,中央空化,核邊緣化。見圖10。

圖10  瑞姬方法染色空泡型蟲體

4.5 電鏡觀察

何妮等介紹:B.h.電鏡觀察可根據(jù)包囊有無纖維外衣將其分為纖維包囊型和包囊型2種。纖維包囊型能吸附細(xì)菌和其他包囊,導(dǎo)致異體宿主感染。2種包囊型內(nèi)部結(jié)構(gòu)大體相同。B.h.漿內(nèi)含有粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、糖原顆粒等,細(xì)胞核內(nèi)有異染色體,線粒體差異變化大,細(xì)胞膜有微吞飲功能,細(xì)胞外可能包被纖維外衣。在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),B.h.包囊形成過程中蛋白代謝增強,細(xì)胞核周圍及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域管溝樣機(jī)構(gòu)增加 。

5 采用不同檢查方法與形態(tài)特征

對B.h.而言,檢查方法與檢出率密切相關(guān),不同的染色方法有不同形態(tài)特征,學(xué)者曾進(jìn)行的不同嘗試與經(jīng)驗,現(xiàn)分別介紹如下。

5.1 碘染色方法

此為鑒定糞便阿米巴包囊經(jīng)常采用的方法,取一滴碘液在載物片上,用牙簽采取糞便少許,涂成薄片,加蓋蓋玻片鏡檢,低倍鏡可以看到B.h.呈耀眼亮點,高倍鏡可看到B.h.當(dāng)中的空泡,此可與其他包囊鑒別,見圖11。如果蟲體較少、糞便標(biāo)本排出時間過長或標(biāo)本保存不好就難以檢出。

注:A為結(jié)腸阿米巴包囊(下面)和多態(tài)性B.h.的顆粒型蟲體(上面)。B為可看到二分裂蟲體的標(biāo)本。無論哪一種蟲體,都可以染成黃色,在細(xì)胞質(zhì)周圍可見顆粒狀的線粒體樣物質(zhì)和細(xì)胞核(B.h.)特征

圖11  患者糞便標(biāo)本碘染色

5.2  Cone染色液方法

本方法優(yōu)點為直接檢查與固定標(biāo)本同時進(jìn)行。將糞便標(biāo)本涂成薄片,在涂片標(biāo)本處于半干狀態(tài),滴加染色液(見配方),染色30min,用蒸餾水輕輕沖洗,加蓋片鏡檢。染色適宜度為酵母菌等濃染。B.h.呈深藍(lán)色或黑色,此為染色液特異性的結(jié)果,見圖12a。鏡檢發(fā)現(xiàn)染色不理想時,仍然可重新再染1次。如果想永久保存標(biāo)本,可采取蒸餾水沖洗后干燥,或用乙醇梯度脫水,用二甲苯透明后,再用光學(xué)樹脂封片。在此染色片中,油鏡下可看到蟲體周圍有一圈空白區(qū)(此為B.h.周圍1層纖維狀結(jié)構(gòu)不被染色而形成的空白區(qū)),這可與其他原蟲進(jìn)行鑒別 ,見圖12b。

染色液配制: 90%乙醇170 mL;100%甲醇160 mL;醋酸20mL;石炭酸20 mL;1%磷鎢酸12 mL。將上述試劑注入618mL的蒸餾水中,混合均勻,加入氯碳混合劑(武藤化學(xué)和光純藥工業(yè)產(chǎn)品)5g,混合后備用。

注:A為B.h.濃染時呈深藍(lán)色甚至黑色,但看不到內(nèi)部構(gòu)造;B為淺染色時,可以看到中央的空泡和顆粒狀的細(xì)胞質(zhì),在蟲體周圍呈1個輪廓的“空圈”,可為鑒別特征。

圖12  患者糞便標(biāo)本cone染色

5.3 MIF固定染色方法

適用于糞便中原蟲及蠕蟲蟲卵的固定、染色和標(biāo)本保存,原蟲與蟲卵標(biāo)本可長期保存。但B.h.不期望長期保存,只是短時間盡可能將標(biāo)本處理,僅存留一部分標(biāo)本作為長期保存?zhèn)湟院笫褂?。使用甲醛固定的?biāo)本不能保持其原來的圓形形態(tài),空泡型與顆粒型會形成多種多樣形態(tài),見圖13。

注:B.h.形態(tài)不固定,中央空泡染色不均勻,在周圍細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有線粒體樣結(jié)構(gòu)和核,此點為鑒定特征

圖13  糞便標(biāo)本MIF固定染色方法

5.4 培養(yǎng)方法

以下介紹的方法為簡單且檢出率高的方法,之后還可進(jìn)行遺傳學(xué)檢查,特別適用于DNA測定,很有實用價值。雖然已經(jīng)報道多種培養(yǎng)基方法,但以液體培養(yǎng)基更為簡單方便。液體培養(yǎng)基組成:氯化鈉8.5g;氯化鈣0.33g;氯化鉀0.3g;天門冬酰胺0.5g。

培養(yǎng)基制作:用1mol/L的NaOH調(diào)整蒸餾水pH 7.0~7.4,加至1 000mL。放置120℃,高壓滅菌20min,滅菌后備用,放入冰箱可保存一年以上。加入無菌馬血清,制作成液體培養(yǎng)基,放入冰箱可保存1個月以上。此外,可分裝在5~15mL塑料管中滅菌后備用。培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)容器70%容量即可。

培養(yǎng)基放置冰箱冷藏,接種標(biāo)本時,必須將培養(yǎng)基置于室溫事先預(yù)熱,將新鮮糞便培養(yǎng)放入培養(yǎng)基,用滅菌棒攪拌均勻。與放入糞便量有關(guān),一般采用15mL的塑料管,放入1g糞便較適宜。如果采用微型管,一般在5~10mg(3倍火柴頭大小)為宜。

放入37℃溫箱培養(yǎng),2~5d,每天以滅菌吸管,吸取管底沉淀物表面,放載物片,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下進(jìn)行觀察。可見B.h.繁殖的蟲體。見圖14、15。由于糞便內(nèi)細(xì)菌繁殖,培養(yǎng)管內(nèi)產(chǎn)生壓力,培養(yǎng)管可能發(fā)生自然脫落現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)管蓋脫落時,內(nèi)容物可能噴出,污染溫箱或環(huán)境。另外,培養(yǎng)蟲體在2d急劇繁殖,消耗營養(yǎng)多,需要在次日轉(zhuǎn)種1次新培養(yǎng)基,保持繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基中渣滓較少時,進(jìn)行DNA提取為宜。

注:可以看到呈圓形大小不等的蟲體,也可觀察到多形態(tài)的阿米巴型蟲體

圖14 培養(yǎng)繁殖的蟲體(活體形態(tài))

注:能清楚看到多核蟲體,2個核的端極都以對角線形式存在,形成“雙眼”狀態(tài)

圖15 培養(yǎng)的姬姆薩染色蟲體

5.5  3種方法聯(lián)合檢查觀察

該方法為阿米巴原蟲經(jīng)典染色方法 ,眾多教科書的阿米巴原蟲圖譜大都依此法染色。1948~1963年,筆者在協(xié)和醫(yī)院寄生蟲室對糞便寄生蟲常規(guī)的檢查中,每例患者標(biāo)本均采用糞便直接涂片、碘染色、硫酸鋅漂浮法3種方法聯(lián)合顯微鏡檢查,凡遇到原蟲且即便是可疑時,必須進(jìn)行鐵蘇木素染色方法制作標(biāo)本,經(jīng)油鏡檢查與鑒定 ,共完成115834例寄生蟲感染患者的檢查與統(tǒng)計,并獲得B.h.檢出率45%的統(tǒng)計結(jié)果?？梢娝脵z查方法決定檢出率高低。

6 臨床表現(xiàn)

B.h.是近20年來被人們所重視與腹瀉相關(guān)的人體寄生蟲,其癥狀無特殊表現(xiàn),易與腸道一般感染相混淆。一旦糞便檢出B.h.即可確診。對于部分慢性腹瀉而病因不明的患者應(yīng)注意該蟲感染的可能。膿血便原因分析可能是紅細(xì)胞能為B.h.提供營養(yǎng)物質(zhì),故而B.h.感染更易存在于黏液膿血便中;再者慢性腹瀉治療不當(dāng)易引起腸黏膜損傷和腸道功能紊亂,甚至出現(xiàn)黏液膿血便,上述情況下B.h.更容易侵入機(jī)體。

胡纓等報道,在對683例惡性腫瘤住院患者進(jìn)行B.h.病原學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn),受感染者112例(16.40%),其中黏液膿血便組感染率顯著高于其他類型糞便組(P<0.05);不同性別、年齡間感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在不同治療組中,化療組感染率最高,為26.40%;在不同腫瘤類別組中,消化系統(tǒng)組的感染率最高,為28.51%;低清蛋白組感染率顯著高于清蛋白健康組(P<0.05);免疫功能低下組感染率顯著高于免疫功能健康組(P<0.05)。B.h.大量繁殖導(dǎo)致感染者不同程度的腸道病變,其臨床表現(xiàn)無特異性;大部分感染者主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、腹脹、厭食、惡心、嘔吐等癥狀;部分感染者可出現(xiàn)乏力、發(fā)熱、全身不適等,易與一般炎性反應(yīng)相混淆;個別重癥患者可導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉、低蛋白血癥、全身水腫等,甚至危及生命。

7 治療

治療本病多采用甲硝唑(滅敵靈),每次口服250mg,每日3次,5~10d為1個療程,可使糞便陰性。部分復(fù)發(fā)或治療無效,可加大劑量為750 mg。對于不同的蟲株,敏感性可能不同。對于耐藥患者,可采用復(fù)方磺胺甲噁唑、痢特靈、雙磺喹啉、黃連素或鴉膽子治療。黃道超等認(rèn)為,甲硝唑療效好、不良反應(yīng)小,廉價安全,使用方便,且具有抗厭氧菌作用,可被作為治療人和動物阿米巴病的首選藥物。

8 小結(jié)

有學(xué)者指出,新現(xiàn)和再現(xiàn)感染性疾病已經(jīng)成為影響人民健康重要的公共衛(wèi)生問題。作為從事醫(yī)學(xué)教育、研究、臨床和預(yù)防的衛(wèi)生工作者,應(yīng)積極應(yīng)對,不斷學(xué)習(xí),充實和擴(kuò)大專業(yè)知識面,同時還要擔(dān)負(fù)起宣傳、教育的職責(zé),提高全體民眾的衛(wèi)生防病意識。

筆者強調(diào),檢驗醫(yī)學(xué)在臨床及衛(wèi)生領(lǐng)域起到舉足輕重的作用,是臨床醫(yī)學(xué)不可缺的組成部分。增加新現(xiàn)和再現(xiàn)寄生蟲的認(rèn)識,提高寄生蟲感染認(rèn)識和寄生蟲形態(tài)鑒別與檢出率是當(dāng)務(wù)之急,刻不容緩。