科學技術振興機構（ＪＳＴ）

東京大學

開發(fā)在細胞外復制和進化的人工基因組DNA ~期待構筑自主增殖進化的人工細胞~

重點 生物可以利用寫在基因組DNA上的信息復制DNA進行進化，但具有這種能力的人造物體至今還沒有被制造出來。 本研究通過利用人工基因組DNA和無細胞轉錄翻譯系統，世界上首次成功地進化出了在細胞外表達基因的同時進行復制的DNA。 通過向該人工基因組DNA中添加基因，將來可以構建能夠自主增殖的人工細胞，有望為高效的有用物質生產做出貢獻。

在JST戰(zhàn)略性創(chuàng)造研究推進事業(yè)中，東京大學研究生院綜合文化研究科廣域科學專業(yè)附屬先進科學研究機構/生物普遍性聯合研究機構的市橋伯一教授等人僅使用核酸和蛋白質等非生物材料，在細胞外首次成功地進行了來自生物特征DNA的基因表達和持續(xù)復制的進化。增加和進化是生物的一大特征，但具有這種特征的人造物體至今還沒有被制造出來。 本研究小組通過使用含有DNA復制所需的2個基因的環(huán)狀DNA (人工基因組DNA )和無細胞轉錄翻譯系注1 )，成功地將基因翻譯成蛋白質，通過其翻譯的蛋白質復制了原來的環(huán)狀DNA。 并且通過將這個DNA復制周期持續(xù)約60天，成功進化成了復制效率上升了約10倍的DNA。 如果在這次開發(fā)的人工基因組DNA中追加轉錄翻譯所需的基因，將來只要提供氨基酸和堿基等低分子化合物，就可以發(fā)展成自主增殖的人工細胞。 如果產生了那樣的人工細胞，我們就可以期待現在進行的醫(yī)藥品開發(fā)和食品生產等使用生物的有用物質生產會變得更加穩(wěn)定和容易控制。 本研究成果于2021年11月16日(美國東部時間)在美國科學雜志《ACS SyntheticBiology》的在線版上公布。 本成果通過以下事業(yè)研究領域研究課題獲得。 戰(zhàn)略性創(chuàng)造研究推進事業(yè)團隊型研究( CREST ) 研究領域:“通過基因組尺度的DNA設計·合成創(chuàng)造細胞控制技術” (研究總結:鹽見春彥慶應義塾大學醫(yī)學部教授) 研究課題名稱:“開發(fā)自我再生產和進化的人工基因組復制轉錄翻譯系統” 研究代表人:市橋伯一(東京大學研究生院綜合文化研究科教授) 研究期間:令和2年11月~令和8年3月 在這個領域，JST的目標是闡明基因組的工作原理和創(chuàng)造細胞利用的基礎技術。 上述研究課題的目標是開發(fā)一邊自我再生產一邊復制進化的人工基因組DNA。

<研究背景和經過>

增加和進化是生物的一大特征。 由于生物具有增加的能力，可以用于食物和醫(yī)藥品等廉價的生產。 因為可以進一步進化，所以也可以改良品種。 但是，由于生物不能適合人類，所以使用生物制作的控制性和穩(wěn)定性有限。 如果能夠制造出增加并具有進化能力的人工分子系統的話，就可以期待能夠更加高效穩(wěn)定地進行至今為止依賴于生物的有用物質生產。 對生物“不斷增加進化的能力”來說，最重要的條件是要長期持續(xù)復制生物設計圖即基因組DNA。 在這個復制過程中，基因組DNA發(fā)生變異，如果該變異有利于子孫的數量和生存，那么該變異就會通過在群體中傳播而發(fā)生進化。 因此，為了開發(fā)不斷增加進化的人工分子系統，首先需要長時間持續(xù)進行DNA的復制。 要像生物一樣進一步進化，并不只是復制DNA就可以了，需要翻譯寫在DNA上的信息(基因)使蛋白質表達，根據其蛋白質復制DNA。 迄今為止，還沒有實現這種DNA復制所需的基因的表達和由此產生的DNA復制同時發(fā)生的反應體系構建。 造成這種情況的一大障礙是，DNA復制所需的基因很多(大腸桿菌型的DNA復制約20種，病毒型需要4種)，而且其中一部分需要高濃度的蛋白質，所以現在的無細胞轉錄翻譯系統很難以充分提供所有的基因。

<研究內容> 因此，本研究小組決定人工制作出用更少的基因、低濃度的蛋白質就能達成的DNA復制結構，而不是像生物使用的那樣精巧但需要大量基因的復雜的DNA復制結構。 在這次使用的DNA復制機制中，只需要2種基因( Phi29 DNA復制酶注2 )和Cre重組酶注3 ) )就可以復制環(huán)狀DNA (稱為人工基因組DNA ) (圖1 )。 首先，Phi29 DNA復制酶一邊從環(huán)狀DNA中的不特定位置剝離雙鏈DNA，一邊合成互補DNA。 雖然作為模板的DNA呈環(huán)狀，但由于自身合成的DNA鏈會被剝離，進一步繼續(xù)合成，最終將形成長達數十公里的堿基對的長直鏈狀單鏈DNA。 另外，DNA復制酶合成互補鏈，形成長雙鏈DNA后，Cre重組酶發(fā)生作用，對被稱為loxP的34堿基對的DNA序列之間發(fā)生同源重組。 因為原來的環(huán)狀DNA中含有1個loxP序列，所以其間如果發(fā)生同源重組，環(huán)狀DNA就會再生。 以上的DNA復制機制只需要兩個基因就可以進行遞歸環(huán)狀DNA的復制。 另外，預計這兩種蛋白質在低濃度下也可以充分發(fā)揮作用，在現在的無細胞翻譯系統中可以充分表達量。 

  本研究首先驗證了該人工基因組DNA是否可以持續(xù)復制。 用無細胞轉錄翻譯系統對人工基因組DNA進行了圖1所示的反應。 于是，DNA被復制了1000倍以上(圖2，第1回合)。 為了確認DNA的持續(xù)復制，取出一部分反應液用新的無細胞轉錄翻譯液稀釋，同樣嘗試進行下一輪的轉錄翻譯復制，結果DNA增加了2倍左右(圖2、第2回合)。 照這個樣子反復稀釋和反應多次傳代，DNA的增加就會慢慢惡化，8次傳代后DNA完全不增加了。 其理由是在復制中會發(fā)生因復制錯誤而破壞基因功能的變異，如果反復復制，總有一天基因會損壞。 問題是，擁有這些壞基因的DNA也會繼續(xù)被其他從正?；蛑斜磉_的蛋白質復制，最終正常基因消失，整體上停止復制(圖3左)。除去具有這種壞基因的DNA的方法之一是，像細胞一樣導入分區(qū)結構，將每個細胞的基因組DNA數量限定為少數(如果可能的話為1個)。 這樣一來，帶有壞基因的DNA由于無法制造正常的蛋白質而無法復制，不久應該就會被稀釋(圖3右)。 作為這樣的分區(qū)結構，使用了直徑0.5~0.8微米( m )的油中水滴。油中水滴可以通過在礦物油中加入表面活性劑和反應溶液，劇烈攪拌來制作。 

 在這樣制作的水滴中封入人工基因組DNA和無細胞轉錄翻譯反應液，在30度下進行16小時的圖1所示的DNA復制反應。 然后，如圖4A所示用含有新的無細胞轉錄翻譯系統的水滴稀釋，進行下一輪的反應。 在這樣的分區(qū)結構中進行傳代反應后，與之前的結果不同，經過8個回合后復制仍持續(xù)(圖4B )。 而且當初DNA濃度有逐漸下降的趨勢，但到了18回合后突然變得經常增加，能夠持續(xù)進行DNA復制到60回合( 60天，相當于140代)。 在30個回合的時候，分離出18個DNA，對其序列進行調查，平均有7個變異，其中5個是過半數的DNA共有的。 另外，分離出的多數DNA的復制能力與原來的DNA相比最大上升到了約10倍(圖5 )。 這表明發(fā)生了適應性進化。 這里重要的是，在這個實驗中，研究者并不是有意選擇了復制量特別高的DNA。 研究人員進行的只是每天調整、稀釋水滴，用30度加熱。 作為操作，與傳代培養(yǎng)微生物沒有太大差別。 核酸和蛋白質等無生物分子的集合只是“培養(yǎng)”，DNA就開始自由進化，這一點具有本研究的新穎性。

另一個有趣的現象是，DNA濃度的推移以劇烈波動的方式反復上升和下降(圖4B、20回合和50回合左右達到極大)。 我認為這種現象可能是因為出現了寄生型的DNA。 實際上，研究了DNA濃度每20個回合增加的DNA，發(fā)現除了原來的人工基因組DNA以外，由缺失了DNA復制酶和重組酶兩種基因的100個堿基長度左右的重復結構構成的DNA過度擴增。 由于這個DNA不具備DNA復制所需的基因，所以不能單獨增加，但如果在同一區(qū)域內存在正常的DNA，就可以寄生于它而增加。 同樣的寄生型復制體的出現和振動的濃度推移，在本研究的作者們進行的RNA進化實驗注4 )中也被觀察到( Furubayashi et al eLIFE 2020 )，可以認為同樣的現象在DNA的情況下也發(fā)生了。 寄生型復制體無論是RNA還是DNA都很快出現了，這暗示著寄生種的出現對基因組復制系統來說是普遍的現象。

<今后的展開> 雖然現在的人工基因組DNA中只搭載了DNA復制所需的2個基因，但可以通過導入其他基因來擴展人工基因組DNA所具有的功能。 例如，由于現在放在無細胞翻譯系統中的RNA和蛋白質也能從基因組DNA中表達，今后，如果載有轉錄翻譯所需的所有基因，只需提供氨基酸和堿基等低分子化合物，就可以發(fā)展成自主增殖的人工分子系統 。導入膜合成基因的話，有可能產生細胞膜。 另外，如果翻譯的蛋白質功能不充分，也可以通過進化來提高其功能。 如果以本研究開發(fā)的人工基因組DNA為核心，則可以期待構建出自主增殖的人工細胞。 可以認為，如果形成這種自主增殖的人工分子系統，現在依賴生物的醫(yī)藥品開發(fā)和食品生產等就可以被這種系統取代。 生物雖然結實穩(wěn)定，但是不能方便人類。 另外，生物的工作原理中還留有很多黑匣子。 因此，使用生物制造總是有限制。 另一方面，如果是人工構筑的分子系統，則只包含必要的要素，全部可以用已知的物質制作，所以設計和控制變得容易。 將來，通過使用這樣的人工系統，期待能夠更穩(wěn)定地控制目前使用生物的有用物質的生產。

＜參考圖＞

圖1人工設計的DNA復制的結構

由DNA表達2種蛋白質，通過Phi29 DNA復制酶由環(huán)狀DNA合成雙鏈長的直鏈狀DNA。 之后，Cre重組酶在分子內發(fā)生同源重組，使環(huán)狀DNA再生。 這時產生的環(huán)狀DNA的大小本來就有可能大兩倍、三倍。 另外，也存在不變成環(huán)狀DNA，直接復制長直鏈狀DNA的路徑。 這種DNA復制的結構曾于2006年由海外小組提出，但由于Cre重組酶強烈阻礙DNA復制酶的功能，多年來一直未能實現( Forster et al 2006 Mol Sys Biol )。 在本研究組的前期研究中，獲得了抑制效果小的DNA復制酶突變體( Sakatani et al 2018 Sci Rep )，使本研究成為可能。

圖2在無分區(qū)結構的條件下傳代時的DNA濃度推移

由DNA表達2種蛋白質，通過Phi29 DNA復制酶由環(huán)狀DNA合成雙鏈長的直鏈狀DNA。 之后，Cre重組酶在分子內發(fā)生同源重組，使環(huán)狀DNA再生。 這時產生的環(huán)狀DNA的大小本來就有可能大兩倍、三倍。 另外，也存在不變成環(huán)狀DNA，直接復制長直鏈狀DNA的路徑。 這種DNA復制的結構曾于2006年由海外小組提出，但由于Cre重組酶強烈阻礙DNA復制酶的功能，多年來一直未能實現( Forster et al 2006 Mol Sys Biol )。 在本研究組的前期研究中，獲得了抑制效果小的DNA復制酶突變體( Sakatani et al 2018 Sci Rep )，使本研究成為可能。

圖3類似細胞分區(qū)結構的效果

左)沒有分區(qū)結構的時候，即使基因被破壞了的DNA也會和其他正常的DNA一樣被復制，所以無法被除去。 右)如果有分區(qū)結構，每個分區(qū)的DNA為1分子的話，基因破壞了的DNA不會被復制，所以不久就會變得不被稀釋，從而被除去。

圖4在有地塊結構的條件下傳代時的DNA濃度推移。

a )在油中水滴中進行如圖1所示的反應，在下一個回合中，用含有新的無細胞轉錄翻譯反應液的油中水滴稀釋，通過攪拌，使水滴內部發(fā)生混合反應。 b )在各回合中測量了DNA濃度。 獨立有兩個系列的實驗，上面給出了其中的一個例子。 兩者的復制都持續(xù)到了最后。 在黑箭頭所示的回合中，由于DNA濃度在檢測靈敏度以下，因此一度取出DNA并人為放大后，再次返回到區(qū)內。

圖5分離的DNA復制能力的比較

對在回合30中分離出的多個DNA進行了圖1所示的轉錄·翻譯·復制反應，比較了含有環(huán)狀、線性DNA的總DNA復制量。

<用語解說> 注1 )無細胞轉錄翻譯系統 含有從細胞外編碼為DNA的基因轉錄RNA，翻譯成蛋白質所需的所有因子的反應液。 本研究特別是由清水義宏(現理化研究所生命功能科學研究中心無細胞蛋白質合成研究小組組長)等在東京大學上田卓也研究室開發(fā)的，全部由純化的已知蛋白質和RNA構成的重構型物質( PURE SYSTEM，Shimizu ) 注2 ) Phi29 DNA復制酶 枯草桿菌噬菌體phi29攜帶的DNA復制酶。 該酶可以以DNA和RNA為引物合成DNA鏈。 由于具有鏈置換活性，可以在分離雙鏈的同時繼續(xù)進行DNA合成。 預計在本研究中，將通過轉錄酶制作的RNA片段作為引物進行復制。 注3 ) Cre重組酶 大腸桿菌噬菌體P1攜帶的DNA重組酶。 可以重組被稱為loxP的34堿基長度的序列。 本研究中使用的人工基因組DNA有一個loxP。 注4 ) RNA的進化實驗 本研究開發(fā)的這種持續(xù)復制進化的系統，過去由本集團的成員用RNA而不是DNA達成( Ichihashi et al.Nat Commun 2013 )。 但是，RNA基因組的情況下，可持續(xù)復制的RNA的長度有限，難以添加基因，缺乏發(fā)展性。 與此相對，此次開發(fā)的DNA基因組目前沒有那樣的限制，可以追加多個基因，期待著各種各樣的應用。